新一代基因编辑工具问世：无需病毒载体完成DNA大片段精准插入

来源：医麦客

2023年3月16日，Seamless Therapeutics宣布获得12万美元（5.11万欧元）的种子轮融资，这笔资金将用于开发用于基因编辑的可编程重组酶。Seamless的重编程位点特异性重组酶平台为基因编辑提供了一系列新选择，包括倒置、切除、交换和插入不同尺寸的DNA片段，理论上，该技术可以靶向基因组内的任何位点。

重组酶被发现至今已经过去几十年，但此前在新靶位点的可编程性方面并没有太大的突破。2022年12月，德累斯顿工业大学（Technische Universität Dresden）癌症中心Frank Buchholz的研究团队研发了一种用于智能生成设计器重组酶（designer-recombinases）的算法：RecGen，这项研究在Nature Communications上发表。

酪氨酸型位点特异性重组酶（Y-SSR）是广泛使用的基因组工程工具，可以在其目标 DNA 序列之间交换DNA链，从而实现DNA的受控切除、倒置、插入或交换，这一基因编辑过程非常精确，区别于传统的CRISPR/Cas9等基因组工程方法，这种基于重组酶的基因编辑工具不需要造成DNA双键断裂，也不依赖于DNA修复机制，提供了一种对基因组DNA的“无缝操作”，并且副作用风险相对较低。不过，这种编辑技术的编辑速度与效率并不算高，还需要大量时间和精力来生成具有量身定制的特异性。

▲ Y-SSR切割原理 图源：参考资料2

研究团队的RecGen算法可以使designer-recombinases适应新目标位点，对目标位点进行一定预测。Frank Buchholz、Felix Lansing和Anne-Kristin Heninger基于这项技术成立了RecTech，如今更名为Seamless，将进一步研究开发基于DNA重组酶的基因编辑系统。

不过，现阶段管线的适应症与靶点仍不明确，而负责公司专有技术持续开发的Felix Lansing认为，这种编辑系统的潜力是无限的，目前公司的模块化平台已经成功将位点特异性重组酶重编程为任意给定的靶序列，打破了这种基因编辑系统目前面临的最大障碍团队希望能够将其所有潜力发挥出来，完成DNA倒置、切除、交换和插入来应用于多种疾病治疗领域。

Heninger表示，目前公司已经开始了管线布局，其中一个特定目标已经在进行临床前实验，剩下的仍处于临床前发现阶段，目前，公司尚未就此透露更多信息。

Seamless的种子轮融资由Wellington Partners和Forbion领投，Wellington Partners广泛投资于生物技术，治疗学，医疗技术，诊断和数字健康领域的早期和成长阶段生命科学公司，投入资金总额超过1亿欧元；Forbion专注于生命科学领域的风险投资，总投资公司超过30家；同时，公司也获得了德国政府支持创新生命科学初创公司的计划——BMBF GO-Bio的非稀释性资金。

DNA重组酶

目前，基因编辑的手段越来越多，包括CRISPR/Cas9 DNA编辑、碱基编辑、甚至是RNA编辑等，利用DNA重组酶进行的基因编辑这一概念似乎较为前沿，也较为少见，但上文中提到的研究并非这一领域的孤例。

DNA重组酶包括位点特异性重组酶、同源重组酶等，是一种来自于噬菌体的遗传操作工具。同源重组酶可以不受核酸内切酶识别位点和DNA分子大小的限制，精确高效地修饰靶DNA分子，在目的片段的两端通过引物设计来扩增与线性化表达载体末端相同的序列；位点特异性重组酶包括酪氨酸重组酶以及丝氨酸重组酶，其重组依赖于序列的特异性，对序列的同源要求性较低。

➤ 在2017年发表于Nature Biotechnol的一项研究中，美国波士顿大学的研究人员提出了一种利用DNA重组酶来完成细胞重编程的设想，并且完成了概念验证研究，论文题为“Large-scale design of robust genetic circuits with multiple inputs and outputs for mammalian cells”。

➤ 在2022年10月10日，张锋的学生Patrick Hsu发现另一种新型重组酶，能够将大段DNA高效整合到人类基因组，该文章在Nature Biotechnol上发表。

在这项研究中，研究人员设计了一种算法来检索噬菌体中的大丝氨酸重组酶（LSR）序列，共发现了6207种具有序列特异性的LSR并对其进行了分类，包括着陆垫型、基因组靶向型或多靶向型，并且指向了三种不同的应用类型。在这篇文献中，研究人员成功在无病毒载体递送的情况下，直接整合质粒或扩增子文库到基因组上，插入的最大DNA片段超过7kb，成功实现了大型DNA片段的精准高效整合。

➤ 2022年11月24日，麻省理工学院的研究团队在Nature Biotechnology上发表了一篇题为“Drag-and-drop genome insertion of large sequences without double-strand DNA cleavage using CRISPR-directed integrases”的研究性论文，开发了一种名为PASTE的基因编辑新技术，结合了CRISPR与丝氨酸重组酶，能够以更安全有效的方式替换突变基因，成功实现了长达36000个碱基DNA长片段的定点插入。

PASTE（Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements）的Cas9切口酶仅切断DNA一条链，在gRNA的引导下切割特定基因组位点，随后，Cas9融合的逆转录酶将丝氨酸重组酶所需的附着位点序列整合进切割位点，丝氨酸重组酶就可以与附着位点结合，将大片段DNA序列插入，在不造成DNA双链断裂的情况下完成基因编辑。目前，研究团队在2021年创立的生物技术公司Tome Biosciences正专注于这一领域，探索PASTE技术治疗囊性纤维化的可行性，并且尝试将这一技术推广至血友病、G6PD缺乏症、亨廷顿舞蹈症等基因缺陷引起的疾病。

▲ PASTE技术原理 图源：参考资料4

小结

在CRISPR编辑系统问世之后，基因编辑领域先后涌现了多种新工具，包括单碱基编辑、PRIME基因编辑等等，一代代推动着基因编辑向更加安全有效的方向迈进。DNA聚合酶的概念验证距今仅仅过去六年，但已经证实了其精准插入大型DNA片段、精准编辑的潜力。这些在去年年底涌现的前沿研究，为复杂基因缺陷疾病的治疗提供了新的工具，不断探索基因编辑的治疗范围，不断提高着编辑人类基因组的安全性与有效性。

参考资料：

1.https://www.biospace.com/article/seamless-launches-with-12-5m-for-programmable-recombinases-platform

2.Schmitt, L.T., Paszkowski-Rogacz, M., Jug, F. et al. Prediction of designer-recombinases for DNA editing with generative deep learning. Nat Commun 13, 7966 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35614-6

3.Weinberg, B., Pham, N., Caraballo, L. et al. Large-scale design of robust genetic circuits with multiple inputs and outputs for mammalian cells. Nat Biotechnol 35, 453–462 (2017). https://doi.org/10.1038/nbt.3805

4.Yarnall, M.T.N., Ioannidi, E.I., Schmitt-Ulms, C. et al. Drag-and-drop genome insertion of large sequences without double-strand DNA cleavage using CRISPR-directed integrases. Nat Biotechnol (2022). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01527-4

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