推荐收藏|细胞基质流感疫苗研究进展

摘要：疫苗开发受到了生产制备所需的长时间和高成本的阻碍。2019年末首次报道的一种新冠状病毒（SARS-CoV-2）引发的大流行，使疫苗的生产活动空前迅速，这与传统的疫苗开发周期背道而驰。关键的是，这一进展很大程度上是利用了现有技术，其中许多技术都是从流感疫苗开发开始的。然而，目前至少有90%的流感疫苗依靠鸡胚生产，基于鸡胚生产流感疫苗也是一个时间密集的过程，从生产商收到疫苗株到交付疫苗之间需要大约5~6个月的时间。如果大流行病毒对产蛋家禽致命，那么在大流行期间维持充足的鸡胚供应以满足不断增长的疫苗需求可能会进一步受到影响。考虑到流感暴发的时间不可预测，以及新毒株出现后对疫苗的快速需求，世界卫生组织（WHO）长期以来一直主张为制造流感病毒疫苗建立鸡胚替代平台。细胞培养一直是流感病毒疫苗制造的一个有吸引力的替代平台，因为它可以通过预先呈指数级扩增的细胞库快速启动，然后扩大培养病毒，快速生产制备流感疫苗。本文将对细胞基质流感疫苗的研究进展做一综述。

一、细胞基质流感疫苗的发展历史

全球每年有数百万人感染流感病毒，可导致严重症状，甚至引发死亡，严重威胁人类健康。疫苗是预防控制流感，降低流感相关死亡率的最有效措施。自20世纪30年代，一种在鸡胚中培养流感病毒的方法被开发出来，使用鸡胚制造流感疫苗的方法不断被开发出来。自20世纪50年代末建立MDCK细胞系以来，流感病毒可以在MDCK细胞和Vero细胞等多种细胞中培养的事实被揭示，流感疫苗的制造基质逐渐开始从鸡胚转变为细胞，见图1。2019年3月WHO发布了《2019—2030年全球流感战略》，其中指出针对当前基于鸡胚的传统流感疫苗存在的潜在不足，需要积极优化目前流感疫苗生产技术，其中涵盖了细胞基质流感疫苗技术。近年来，细胞基质流感疫苗研发与产业化取得了较大进展。

图1 流感疫苗基质从鸡胚到细胞的发展变化

二、细胞基质流感疫苗与鸡胚基质流感疫苗比较

尽管全球范围内仍主要使用鸡胚培养的传统方法，但它有明显的缺点，见表1。以鸡胚为基础的疫苗可能会导致对卵清蛋白的过敏反应，尽管事实上，注射/鼻内注射流感疫苗后对鸡胚蛋白成分的过敏很少发生（据报道，只有1.3%的儿童和0.2%的成人），而且疫苗中的鸡胚蛋白成分（如卵清蛋白）含量现在非常低（≤1µg/0.5 mL剂量的传统鸡胚基质流感疫苗和0.24µg/0.2 mL剂量的流感减毒活疫苗）。并且当对鸡胚的需求突然增加时，例如在大流行期间，供应可能不足，阻碍了疫苗的及时生产。1997-2008年禽流感的爆发，特别是高致病性禽流感（HPAI）A/H5N1的爆发，推动了为流感病毒疫苗生产开发不同平台的重大推动，以补充鸡胚的生产。最重要的是，病毒在鸡胚中的连续传代，尤其是在存在H3N2的情况下，可导致抗原位点的鸡胚适应性突变，导致抗原性改变，从而降低疫苗效力。对于减毒活疫苗，这些疫苗只能要使用“无特定病原体”（SPF级）的鸡胚，因为流感减毒活疫苗不会像灭活疫苗那样的的灭活过程来解除任何潜在的不定因素。在保护效力方面，2022年进行的一项系统综述，对相关文献进行了回顾（1项为临床试验，7项为回顾性队列），并分析了过去十年中比较细胞基质疫苗和鸡胚基质疫苗有效性的研究，结论是没有足够的证据表明基于细胞培养的流感疫苗在疗效方面优于基于鸡胚的疫苗。为了克服这些缺点，开发了基于细胞培养的疫苗生产技术，使用的细胞系包括MDCK细胞、C6细胞、Baxter细胞、Vero细胞和Sf9昆虫细胞等。

表1. 细胞基质流感疫苗于鸡胚基质流感疫苗比较

三、细胞基质流感疫苗研究进展

细胞培养一直是流感病毒疫苗制造的一个有吸引力的替代平台，因为它可以通过预先呈指数级扩增的细胞库快速启动，最大程度的缩短流感疫苗生产周期。用于季节性流感疫苗生产的既定方案通常可用于大流行性流感生产，尽管对于HPAI，在大规模疫苗生产之前，必须使用反向遗传学技术对HA进行基因编辑，以保证鸡胚和疫苗生产人员的生物安全。疫苗生产能力取决于可用细胞发酵罐的大小和数量（通常每个发酵罐约2000~6000 L）以及生产中病毒株的产量。

早在2001年，美国Sekirus公司生产Flucelvax® Quadrivalent（Flucelvax®TETRA）四价流感疫苗，这是一种在无血清微载体贴壁培养的MDCK细胞生产的亚单位疫苗。Flucelvax® Quadrivalent于2012年在美国首次获得许可，目前可用于4岁及以上的儿童。2007年Novartis公司采用无血清悬浮培养的MDCK 33016细胞系生产的三价亚单位疫苗Optaflu获得欧盟批准上市。FDA于2016年批准Seqirus的四价流感亚单位疫苗Flucelvax Quadrivalent，该疫苗也是基于无血清悬浮MDCK细胞生产制备。韩国SK Chemicals公司生产的SKYCellflu三价和四价亚单位疫苗也是由MDCK细胞生产，在韩国获得6个月及以上的许可，在马来西亚和泰国获得3年及以上的许可，其他已上市的细胞基质的季节性流感疫苗汇总见表2，这些疫苗均是以MDCK细胞或Vero细胞作为细胞基质。遗憾的是，我国至今还没有基于细胞培养的流感疫苗获批上市，但是诸如武汉生物制品研究所、长春生物制品研究所等疫苗企业均在积极布局细胞基质的流感疫苗研发。

表2. 已经上市的细胞基质的季节性流感疫苗

注：EMA：欧洲药品管理局；FDA：美国食品药品监督管理局

MDCK细胞是由Madin和Darby于1958年从犬肾脏组织分离培育建立的贴壁培养型细胞系，相较于其他细胞系，流感病毒在MDCK细胞中复制更迅速，可以在3~10代内快速适应获得高产病毒株，从而缩短疫苗株生产的时间，同时适应性代次的减少也可以降低疫苗株在传代过程中适应性突变发生的可能性。因此MDCK细胞成为公认的最适合于流感病毒毒株分离和疫苗生产的重要细胞系之一。此外，该细胞系较易于适应无血清培养基，以及无血清悬浮驯化，有利于大规模产业化生产。

Vero细胞是世界卫生组织推荐的疫苗生产细胞系。2010年，Baxter生产的三价流感灭活疫苗Preflucel在欧盟获批上市，该产品正是基于Vero细胞无血清贴壁培养生产的。研究表明Vero细胞对不同型和亚型的流感病毒也具有较为广泛的敏感性，但其病毒扩增效率低于MDCK细胞和鸡胚。Vero细胞流感疫苗产量较低，如何快速培育流感病毒Vero细胞高产适应株是Vero细胞流感疫苗研发的关注点。

四、细胞培养流感疫苗的生产工艺

细胞培养流感灭活疫苗的生产工艺与许多其他细胞制备的疫苗相似，一般流程为：细胞培养、病毒培养收获、离心澄清、病毒灭活和裂解、病毒纯化、制剂。在大规模的细胞培养过程中，利用微载体培养方式和单细胞悬浮培养方式，主要使用无血清培养基，见图2。无血清培养过程可以限制和避免血清带来的一些不足，如易受微生物、病毒和支原体等的污染，批次间的差异使不同批次病毒疫苗的质量难以严格控制，大量血清蛋白的存在增加了中下游分离纯化的难度等。

图2. 常规细胞基质灭活流感疫苗生产工艺

五、展望与总结

尽管自发现流感病毒以来，在过去的80年中，针对人类的多种疫苗方法不断发展，但流感继续给人类和动物造成重大疾病负担。几十年来，全球科学研究机构和实验室将MDCK细胞广泛应用于流感病毒的分离、培养和实验室诊断，然而MDCK细胞作为传代细胞系用于疫苗生产，其潜在的成瘤性、致瘤性以及外源因子污染风险成为广泛关注的问题。然而，随着疫苗细胞基质的改进以及流感疫苗生产工艺的推进，笔者相信细胞基质流感疫苗全面取代鸡胚基质流感疫苗只是时间问题。

参考文献

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