Nat Chem Bio丨王前奔/刘善虑/董一洲合作开辟应用靶向肺蛋白酶mRNA的Cas13d纳米系统防治重度新冠病毒感染新途径

目前FDA紧急授权使用的抗新冠病毒 （SARS-CoV-2） 药物，如辉瑞口服药Paxlovid  (奈玛特韦/利托那韦) 和默克口服药Molnupiravir （莫努匹韦） ，主要通过作用于病毒本身达到阻断病毒的复制，降低病毒滴度从而抑制感染的效果。虽然这些药物在不同程度上降低了住院和死亡风险，但是关于奈玛特韦/利托那韦在某些人群中的耐受性和药物干扰的安全性问题，以及莫努匹韦在人体细胞中的致癌突变倾向一直存在争议。所以，研发控制 SARS-CoV-2 感染的新策略仍然是当务之急。

2022年7月25日，杜克大学医学院王前奔教授团队、俄亥俄州立大学感染疾病研究所刘善虑教授团队和俄亥俄州立大学药学院董一洲教授团队合作在Nature Chemical Biology 杂志上发表了题为 Cas13d knockdown of lung protease Ctsl prevents and treats SARS-CoV-2 infection 的研究论文， 创新性地提出了用靶向宿主肺蛋白酶Cathepsin L （Ctsl）mRNA的CRISPR/Cas13d脂质纳米系统预防和治疗重度新冠感染的新途径。该论文首次发现CRISPR不仅预防， 更可以治疗新冠感染。另外，该论文首次证明用阳离子脂质简单修饰已被FDA批准的MC3脂质纳米，就可以有效递送Cas13 mRNA/gRNA至非肝组织并高效特异地降低靶基因表达。这一技术未来可以被广泛推广用于抗感染和抗肿瘤等疾病的治疗。

长期以来，肺蛋白酶Ctsl （组织蛋白酶L） 被认为是重要的内体半胱氨酸蛋白酶，它激活病毒的刺突 （S） 蛋白，从而通过促进病毒-宿主细胞内体膜融合介导病毒进入细胞。前期研究和本篇论文发现Ctsl可介导多种冠状病毒进入人体细胞， 如SARS-CoV-1 （萨斯病毒） , MERS-CoV （中东呼吸综合征病毒） 和新冠病毒及其德尔塔和奥米克戎变异株。因此，Ctsl被认为是一个重要的治疗新冠病毒感染的靶点。虽然之前的研究证实了Ctsl 抑制剂可以阻止冠状病毒 （如SARS-CoV-2 和 SARS-CoV-1） 进入体外培养的细胞，但是尚无成功应用 Ctsl 抑制剂治疗动物冠状病毒感染的报道。目前尚不清楚Ctsl 抑制剂在体内缺乏抗病毒效力是药物功效或递送的问题还是 Ctsl 本身在体内缺乏生理功能。在本篇论文中，作者成功构建了一个靶向肺并携带直接敲低Ctsl mRNA 的Cas13d (CasRx) mRNA/gRNA的脂质纳米系统，实现高效、特异、安全地降低小鼠肺Ctsl mRNA的表达，取得预防和治疗重度新冠感染的显著效果。

由于组织蛋白酶在免疫反应，自噬以及发育等许多过程中具有非常重要的生理作用，作者采用了靶向RNA的CRISPR/Cas13d (CasRx) 系统瞬时敲低Ctsl mRNA，而未用CRISPR/Cas9 系统将这个基因删除。为了将这一系统递送到宿主肺部，作者在德州大学西南医学中心Daniel J. Siegwart教授实验室开发的器官选择性 （SORT） 纳米材料 （Cheng et al. Nat Biotechnol, 2020） 的基础上，通过调整阳离子脂质体 （DOTAP） 的摩尔比例（0-50%），构建了基于MC3 的肺选择性纳米递送系统。

值得一提的是，作者通过肺靶向纳米材料递送CasRx-pre-gCtsl (LNP-CasRx-pre-gCtsl) 实现了安全高效以及专一降低靶器官内靶基因的表达，这一点在正常鼠 （C57BL/6） 中也得到了验证。

在用致死量 （10⁵ PFU） SARS-CoV-2攻击的K18-hACE2 鼠中，如果病毒感染前两天和后一天两次眶后静脉注射LNP-CasRx-pre-gCts即可增加一半鼠的存活。

为了进一步探索LNP-CasRx-pre-gCtsl是否可以用于治疗,作者将其注射时间设置在病毒感染后的两小时和一天。RT-PCR结果显示，LNP-CasRx-pre-gCtsl显著降低了小鼠肺内病毒核衣壳基因 (N) 和包膜基因（E）的表达量。

病理切片显示LNP-CasRx-pre-gCtsl治疗显著降低了小鼠肺部病毒N蛋白的表达， 并明显缓解了由于病毒感染导致的由淋巴细胞和巨噬细胞组成的斑片状以血管为中心的多细胞炎症的肺部浸润病变 （图1） 。研究还发现，在小鼠感染SARS-CoV-2 （10⁴ PFU） 病毒后八小时给予单剂LNP-CasRx-pre-gCtsl，也可获得相似的治疗效果。

图1 文章摘要图

综上，这项研究在国际上首次在体内成功地应用肺靶向纳米系统安全、有效、特异地敲低宿主肺蛋白酶Cathepsin L，从而达到预防和治疗重症新冠感染的效果。鉴于Cathepsin L可介导多种冠状病毒及其变种进入细胞，而且该酶在病毒刺突蛋白上的切割位点也不属于突变频发区域 （如Receptor binding domain） ，靶向Cathepsin L的策略被认为是预防和治疗未来新出现或再次出现的冠状病毒感染的有力手段。 作者所建立的以MC3为基础的器官选择性纳米递送系统既可以携带CRISPR/Cas13d RNA系统， 也可以携带CRISPR/Cas9 DNA系统，靶向不同宿主或病毒因子，用于治疗多种RNA和DNA病毒感染。

值得一提的是，早在2020年3月18日，Protein & Cell杂志发表文章 首次利用Cas13d家族蛋白CasRx在小鼠肝脏中实现了基因的高效沉默，从而证实Cas13d系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性，并讨论了相关工具潜在应用于阻断包括新冠在内的RNA病毒（专家点评丨杨辉/黄鹏羽合作组首次证实Cas13d系统在成体动物体内具有靶向沉默RNA的活性）。

杜克大学王前奔教授团队博士后崔之芬 （Zhifen Cui） 为该论文第一作者，高级研究员王鸿雁 (Hongyan Wang) 博士对论文有重要贡献。该研究得到杜克大学区域生物防护实验室和病理学系Gregory D. Sempowski，Jiaoti Huang, Herman Staats, 和Jeffrey I. Everitt等教授的大力支持。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41589-022-01094-4

制版人：十一

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