真核细胞中，RNA结合蛋白
（RBP）是
调控基因表达的核心角色，控制RNA在细胞内加工、运输、翻译以及降解的时间、地点和速度。RBP对RNA的精巧调控主要依赖于不同RBP对于其同源底物
（cognate substrate）
和非同源底物
（non-cognate substrate）
的特异性区分。明确RBP对RNA底物特异性选择的分子机制，对于理解RNA生物学和制定针对RNA相关疾病的治疗策略至关重要。RbFox家族是一类重要的RNA结合蛋白，广泛的参与到mRNA剪接、miRNA成熟以及其他多种RNA的代谢过程中。RbFox蛋白中高度保守的RRM结构域与5'-GCAUG基序具有nM级别的结合能力，而RNA序列中单个核苷酸的微小变化能够使亲和力降低几个数量级，说明RbFox对同源RNA底物的固有特异性显著高于其他大部分RBP
【1-4】
。然而，RbFox是如何实现其独特的底物选择特异性仍然是本领域的一个重要的未解之谜。
2023年2月9日，哈尔滨工业大学生命科学学院杨帆课题组与合作者，凯斯西储大学的Eckhard Jankowsky和华盛顿大学的Gabriele Varani课题组在Nature Communications上发表题为
Two distinct binding modes provide the RNA-binding protein RbFox with extraordinary sequence specificity
的研究成果。研究
首次揭示了RbFox通过运用在功能及结构上的两种不同的RNA结合模式来实现其非凡的RNA序列选择性
（一种模式以高亲和力特异识别同源RNA底物；另一种模式通过热力学惩罚来容纳所有其他非同源RNA底物）
。对于RbFox这种仅具有单一RNA结合模块的RBP来说，使用截然不同的结合模式来实现高序列选择性，还是一个新颖的概念。更有趣的是，核磁解析的复合物溶液结构显示RbFox的两种模式不仅在RNA结合界面呈现很大的构象差别，更在RNA结合位点的远端出现了显著的构象重排。这个结果提示，与以往对RNA-蛋白质相互作用的认识不同，RNA不只是被动的被RBP调控，RNA也能够通过类似别构效应调控与其结合的RBP，从而影响RBP与下游对象的相互作用。
本研究工作在理解RNA与RBP相互作用的多样性及复杂调控功能方面提供了全新的启示。
在本工作中，研究人员首先利用HiTS-Eq
(High Throughput Sequencing Equilibrium Binding)
，一种全局检测特定RBP与RNA结合能力的技术【5】，建立了一个由16384条随机组合而成的7-mer RNA库，检测了RbFox对所有7-mer RNA变体的结合能力。结果显示，RbFox-RRM对于所有7-mer RNA的亲和力分布呈双峰型
（图1）
：在亲和力低端呈现一个又强又宽的峰，包含了16384条RNA序列里的绝大部份；而含有同源基序5’-GCA(U/C)G的RNA变体组成了高亲和力端的一个强度极小的峰。对比常见的含有单RNA结构域RBP呈现的单峰分布，RbFox的表现是极为特殊的。
图1：RbFox与所有7-mer RNA序列变体的亲和力检测
进一步，研究人员使用两种描述RBP结合RNA能力的模型
（包括：位置权重矩阵（Position Weight Matrix, PWM）
与成对耦合
（pairwise coupling, PWC
）【6】）
，对上述HiTS-Eq得到的RbFox与RNA结合常数进行定量分析。结果发现，虽然PWC模型由于考虑了来自结合位点内部多个位置之间耦合的贡献，实验值和预测值之间的关联度已高达90%，同源RNA底物序列5’-GCAUG仍然是一个outlier。也就是说，RbFox 的双峰亲和力分布并不能用单一的结合模式所解释。因此，研究人员提出，RbFox采用不同的结合模式实现对同源和非同源RNA底物的结合。
随后，研究人员对一个RbFox蛋白的四残基突变体RbFoxmut蛋白的RNA亲和力做了同样的测定
（该突变体改变了RbFox的底物特异性，能够靶向结合癌基因miR21前体从而调控其成熟过程【7】）
。与野生型蛋白相比，RbFoxmut的亲和力分布不再是明显的双峰型，而是显示出与其他RBP比较类似的，呈现拖尾的单峰分布；由于对非同源RNA底物的亲和力普遍增加，峰的分布变窄，整体向相对亲和力更高的方向移动
（图3）
。结果说明，野生型的RbFox正是通过对非同源RNA底物的热力学惩罚，实现了其非凡的RNA序列选择性。
为了进一步探究在两种结合模式下RbFox的结构是否不同，研究者对两条单核苷酸突变的非同源RNA序列，RNA1
（5'-UGCAUAU）
与RNA2
（5'-UUCAUGU）
与RbFox的结合能力进行了核磁共振分析，并解析了RbFox-RNA1复合物的溶液结构。该结构与同源RNA底物复合物的结构相比显示了两个主要区别：首先，在RbFox与RNA结合的界面区域，为了适应非同源序列RNA1，RbFox牺牲了多个氢键和π-π堆叠作用，以高度动态的模式与RNA结合，为前文提出的热力学惩罚模型提供了结构上的证据。更加有趣的是，与同源底物相比，RNA1的A6替代G6，使蛋白N端的R118失去了与G6的Hoogsteen face的氢键作用，调整为与A6的Watson-Crick face的作用。R118在侧链取向上旋转了一个较大的角度，带动K117、N190和E164的取向发生“多米诺骨牌”效应，将构象变化传递到α2、α1这些外围结构元件，重塑了RbFox在远离RNA结合位点的结构和电荷分布
（图2）
。因此，在与RbFox的结合中，RNA底物单个核苷酸的变化不仅引起了RNA结合位点的结合模式改变，还触发了远端表面的结构重排，这是之前没有报道过的重要发现。
图2：Rbfox-RRM与RNA结合复合物的结构比较
叶璇博士与杨文博士为本论文的共同第一作者，杨帆副研究员为论文的最后通讯作者，凯斯西储大学的Eckhard Jankowsky和华盛顿大学的Gabriele Varani教授为共同通讯作者。
哈尔滨工业大学杨帆副研究员（独立PI），长期从事RBP与RNA识别的分子机制研究，相关工作发表在Nature Chemical Biology、Nature Communications、PNAS、NAR和RNA等杂志。杨帆研究组擅长运用液体核磁共振技术和其他生物化学以及生物物理学的方法研究生物大分子的相互作用，除了上述RbFox的研究发现，团队还首次报道了Anti-CIRSPR蛋白存在氧化还原调控开关，相关工作也在近期发表在Nature Communications (Nat Commun | 杨帆团队发现Anti-CRISPRs氧化还原调控新开关)。欢迎有兴趣的同学加入。
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原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-023-36394-3
制版人：十一
[1] Kuroyanagi, H. Fox-1 family of RNA-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 66, 3895–3907 (2009).
[2] Conboy, J. G. Developmental regulation of RNA processing by Rbfox proteins. Wiley Interdiscip. Rev. RNA (2017).
[3] Stoltz, M. Interactions of the alternative splicing factor RBFOX with non-coding RNAs. Thesis, ETH Zurich, Switzerland (2015).
[4] Chen, Y. et al. Rbfox proteins regulate microRNA biogenesis by sequence-specific binding to their precursors and target downstream Dicer. Nucleic Acids Res. 44, 4381–4395 (2016).
[5] Ye, X. & Jankowsky, E. High throughput approaches to study RNA–protein interactions in vitro. Methods 178, 3–10 (2020).
[6] Guenther, U. P. et al. Hidden specificity in an apparently nonspecific RNA-binding protein. Nature 502, 385–388 (2013).
[7] Chen, Y. et al. Targeted inhibition of oncogenic miR-21 maturation with designed RNA-binding proteins. Nat. Chem. Biol. 12, 717–723 (2016).
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