背靠背Nature丨延胡索酸诱导的线粒体相关先天免疫反应新机制

撰文 | 咸姐

癌症是一种多因素疾病，具有不同的病因和结果。然而，所有的癌症都有一些共同的分子特征，其中，细胞代谢的重编程就是肿瘤起始和进展的关键角色。延胡索酸水化酶 （ FH ） 是参与三羧酸 （TCA） 循环的代谢酶，催化延胡索酸盐向苹果酸盐的可逆转化，已被证实是一种肿瘤抑制因子，FH的突变可导致遗传性平滑肌瘤病肾癌 （ HLRCC ，一种以侵袭性肾癌为特征的综合征） 。FH缺陷细胞和肿瘤的一个特点是延胡索酸盐的异常积累，其可通过一系列致癌级联的激活来驱动恶性转化和肿瘤进展 【1,2】 。然而，尽管目前已经清楚FH缺失的长期后果，但是其急性反应尚未可知；而且当人们在肿瘤或其他细胞模型中分析时，所有那些信号级联已经同时被激活，并且很可能交织在一起，这使得阐明它们的层次结构、相互作用和对疾病的因果关系变得困难。

2023年3月8日，来自英国剑桥大学的Christian Frezza团队在Nature上在线发表题为  Fumarate induces vesicular release of mtDNA to drive innate immunity  的文章，建立了一个可诱导的小鼠模型来研究肾脏 FH 缺失所引发事件的时间顺序， 证实细胞内延胡索酸盐水平的增加诱导了线粒体网络的重塑和线粒体衍生囊泡的生成，从而导致mtDNA释放进细胞质中，并随后激活先天性免疫反应。

本文研究人员通过将Fh1^fl/fl品系小鼠与在Rosa26位点上普遍表达他莫昔芬诱导的Cre重组酶的小鼠杂交，获得了他莫昔芬诱导的Fh1^fl/fl品系小鼠，当给予其他莫昔芬时可有效删除Fh1的第3和第4外显子 （即Fh1^-/-） 。利用该模型，研究人员发现FH的缺失确实引起了深刻的代谢变化，而且在他莫昔芬注射第5天就观察到Fh1^-/-肾脏中S- (2-琥珀酰) 半胱氨酸 （2SC） 的早期增加，以及随后在第10天所有代谢标志物 （包括延胡索酸） 都增加。但是，此时从宏观上看，野生型和Fh1缺陷型肾脏之间没有明显的形态学差异。对他莫昔芬注射第5天和第10天的小鼠肾脏进行转录组学分析发现，最普遍改变的生物学过程是与炎症和先天免疫反应相关的通路，而且，与对照肾脏相比，Fh1^-/-肾脏中干扰素刺激基因 （ISG） 增加，促炎细胞因子和趋化因子也增加。

随后，研究人员又从Fh1^fl/fl小鼠肾脏中获得上皮细胞系，用4-羟基他莫昔芬 （4-OHT） 处理后会导致Fh1 mRNA和蛋白质水平以时间依赖性下降，同时伴有线粒体膜电位和呼吸的降低，还诱导了代谢标志物2SC和精氨酸琥珀酸的早期增加，随后是延胡索酸盐的积累，以及Fh1丢失的转录特征。同样的，Fh1缺失细胞中TANK结合激酶1 （TBK1） 被激活，而且干扰素调节因子3 （IRF3） 和下游效应因子STAT1出现时间依赖性磷酸化，伴随着干扰素基因刺激因子 （STING） 的上调和ISG的转录增加。总之，上述动物和细胞实验都表明Fh1的缺失触发了细胞自主的先天免疫反应，从而导致体内和体外ISG的上调。

与此同时，研究人员还在Fh1缺失细胞中观察到包含细胞质DNA的细胞数量随时间而增加，这与Fh1表达缺失的动态相匹配，并与线粒体形态的进行性重塑相吻合，表现为肿胀和肿胀拉长的线粒体。进一步地实验证实，Fh1缺失细胞的胞浆中mtDNA拷贝数随时间增加，并且Fh1的缺失可诱导mtDNA慢性释放到细胞质中，从而引发持续的炎症反应。此外，研究还证实，FH活性的丧失，而不是TCA循环或线粒体代谢的全面损伤，才是炎症反应激活的原因。当利用延胡索酸单甲酯 （MMF） 处理对照细胞以增加延胡索酸的水平时，研究人员发现其可以重现Fh1缺失的所有表型，进一步实验证实线粒体延胡索酸盐水平的增加是mtDNA释放的主要原因，而mtDNA缺失的细胞则不发生后续的炎症反应。由此表明，延胡索酸盐和胞浆mtDNA分别是触发和随后的反应的刺激因素，从而解释了在Fh1缺陷细胞中观察到的先天免疫反应的激活。而随后的实验结果发现，一个包括至少两个细胞质核酸传感器——环GMP-AMP合成酶 （cGAS） 和视黄酸诱导基因I （RIG-I） ——的复杂网络可在mtDNA释放到胞浆中后激活TBK1–IRF3依赖性反应。

最后，研究人员深入探索了FH缺陷介导的mtDNA释放机制，结果发现，已知的一些参与mtDNA释放的基因如Bax和Bak1、Vdac1，或者调节线粒体融合和裂变的主要因子，乃至线粒体转录因子A （TFAM） 都不影响延胡索酸盐依赖性mtDNA释放。通过进一步地实验，研究人员最终证实，SNX9在胞浆mtDNA释放诱导的炎症反应中起着关键作用。SNX9是一种内吞辅助蛋白，在线粒体衍生囊泡 （MDV） 的释放过程中发挥作用。与此同时，由于MDV具有载物选择性，研究人员证实mtDNA的存在对于延胡索酸盐引发的MDV的形成是必要的。在MMF处理前敲低SNX9不仅导致胞浆中mtDNA释放的减少，而且还导致胞浆中MDV的数量减少，同时还检测到线粒体膜上停滞的出芽囊泡。同样的，阻断MDV的释放也影响了核酸传感途径的激活，正如沉默SNX9减弱了TBK1-IRF3的激活以及在MMF处理后观察到的Ifnb1和ISG的表达。由此表明延胡索酸盐的积累驱动了mtDNA以SNX9-和MDV依赖性方式释放到细胞质中，从而触发先天免疫。值得一提的是，上述这些在小鼠中观察到的与Fh1缺失相关的免疫表型也被发现与缺乏FH的人体组织相关。

综上所述， 本研究发现 FH 的缺失导致线粒体形态的早期改变和线粒体DNA（mtDNA）释放到细胞质中，从而触发cGAS–STING–TBK1通路的激活，并激活先天免疫反应，且该反应也部分依赖于RIG-I，同时证实这种表型是由延胡索酸介导的，并通过依赖于SNX9的MDV选择性地发生 。尽管这种先天免疫反应出现得很快，但随着时间的推移，它会持续存在，并且在HLRCC患者中也会出现，这表明在HLRCC中mtDNA释放、慢性炎症和肿瘤发生之间存在直接的相互作用，由此扩展了我们对线粒体影响先天免疫反应方式的理解，并为进一步研究代谢物驱动的免疫病理学提供了基础。

在同天，来自爱尔兰三一生物医学研究所 （TBSI） 的Alexander Hooftman，Dylan G. Ryan和Luke A. J. O’Neill合作，在Nature上发表了题为 Macrophage fumarate hydratase restrains mtRNA-mediated interferon production 的文章，利用代谢组学和同位素示踪，作者发现脂多糖刺激能诱发炎症性天门冬氨酸-精氨酸流动，使得细胞质的延胡索酸水平升高，三羧酸循环 （TCA） 酶延胡索酸水化酶 （fumarate hydratase, FH） 的敲除进一步提升了延胡索酸水平。RNA测序和蛋白组学分析显示，抑制FH会引发强烈的炎症反应，抑制白介素10的表达，增加β干扰素的表达。文章鉴定了FH在维持巨噬细胞细胞因子和干扰素应答稳态中的保护性作用。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-023-05770-w

https://doi.org/10.1038/s41586-023-05720-6

制版人：十一

参考文献

1. The Multiple Leiomyoma Consortium. Germline mutations in FH predispose to dominantly inherited uterine fibroids, skin leiomyomata and papillary renal cell cancer. Nat. Genet. 30, 406–410 (2002).

2. Schmidt, C., Sciacovelli, M. & Frezza, C. Fumarate hydratase in cancer: a multifaceted tumour suppressor. Semin. Cell Dev. Biol. 98, 15–25 (2020).

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