Neuron | 姜有星团队揭示CNGA1门控和离子选择性机制

哺乳动物的环核苷酸门控离子通道(cyclic nucleotide-gated channels, CNG channels)在很多信号转导途径中发挥重要作用， 特别是在视觉和嗅觉感受系统中。感受态细胞的表面受体接收光信号或者化学信号后，细胞内环核苷酸的水平会发生改变，进而调控CNG通道的开放或者关闭。CNG通道产生的电信号激活下游的神经元，哺乳动物因此能感受外界的光线和气味变化【1】。CNG基因突变会诱发色素性视网膜炎（Retinitis pigmentosa）、色盲（Achromatopsia）以及嗅觉紊乱等多种疾病。

CNG通道虽然是电压门控离子通道超家族的一员，但它不受膜电势变化的调控， 而是感受细胞质中环核苷酸水平（cGMP或cAMP）的变化，进而开放或关闭【2】。在哺乳动物中，天然CNG通道是由CNGA（A1、A2、A3、A4）和CNGB（B1、B3）亚基形成的异源四聚体。其中A1、A2、A3亚基各自可形成有功能的同源四聚体，因此经常被用于研究CNG通道的配体调控和离子选择性等【3】。CNG通道是一种非选择性阳离子通道，可以通透Na+、K+和Ca2+等多种阳离子，其中对Ca2+具有更高的亲和力。Ca2+结合在该通道的离子传导路径上会有效阻碍单价阳离子的通透（简称钙阻塞）。

之前的研究报道了线虫CNG通道（TAX-4）在开放（cGMP结合）和关闭（无cGMP结合）状态下的结构，揭示了CNG通道的门控机制【3,4】。但是，CNG通道的离子选择性和钙阻塞机制并不清楚。

2021年3月1日，来自德克萨斯大学西南医学中心的姜有星课题组在Neuron杂志发表文章Structural mechanisms of gating and selectivity of human rod CNGA1 channel，解析了人的CNGA1同源四聚体开放和关闭状态的冷冻电镜三维结构，揭示了不同于经典的电压门控离子通道的门控位置。通过比较不同条件下CNGA1的离子结合状态，揭示了选择性过滤器（selectivity filter，SF）中Ca2+的结合位点。

研究人员首先通过表达优化，获得了均一的蛋白样品，进而利用冷冻电镜技术解析了人的CNGA1同源四聚体开放和关闭状态的结构。CNGA1由跨膜区（S1-S6）和胞质门控装置组成，胞质门控装置一旦与cGMP结合会发生明显的构象变化，这种构象变化经过放大并传导到跨膜区，从而控制通道的开关。孔道结构域（Pore domain， S5-S6）的结构分析显示，cGMP结合之后，S6上两个保守的疏水残基F389和V393，其侧链向通道孔外侧翻转，引发通道开放，故而形成中央门控（图1b）。这也与TAX-4得出的结论一致。

Pore domain的高质量的密度图清楚地显示了结合在选择性过滤器（SF）中的离子的电子密度，对比五种不同条件下的离子结合模式，揭示了过滤器中有两个Ca2+结合位点（1、2）；并且相比于Na+和K+，Ca2+具有更强的结合能力和特异性。

之前的突变和电生理分析表明SF 中保守的酸性氨基酸E365对于钙结合和钙阻塞非常重要，因此推测E365在CNG通道的外侧入口形成主要的钙离子结合位点。但是结构分析显示在E365位置并没有离子的密度。那既然E365不形成钙结合位点，又是怎么发挥作用的呢？为了解释这个问题，研究人员将E365突变成Q并分析Ca2+的结合模式，发现在钙结合位点1、2几乎没有电子密度，说明E365虽然并不直接形成外侧钙离子结合位点，但确实对于钙离子在位点1和2的结合非常重要（图2）。E365Q突变还会使CNG通道变成具有外向整流的电压门控通道。有趣的是，E365Q的结构显示Q365存在两种不同的构象（阻塞构象和导电构象），引发电压门控。

总的来说，通过对比CNG通道关闭和开放状态的结构阐述了其中央门控的机制。过滤器中离子结合模式的分析明确了钙离子的结合位点，阐述了钙阻塞和钙通透的机理。

虽然CNGA1同源四聚体作为CNG通道的研究模型，其结构解析帮助我们理解了CNG通道的门控和离子选择性机制。但是，在体内自然状态下，CNGA亚基和CNGB亚基形成异源四聚体，其具有与体外同源四聚体不同的调控机制，解析真正自然状态下的异源四聚体的结构可以帮助我们更好的理解CNG通道。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2021.02.007

制版人：琪酱

参考文献

1.Bradley, J., Reisert, J., and Frings, S. (2005). Regulation of cyclic nucleotide-gated channels. Curr Opin Neurobiol 15, 343-349.

2.Varnum, M.D., and Zagotta, W.N. (1996). Subunit interactions in the activation of cyclic nucleotide-gated ion channels. Biophys J 70, 2667-2679.

3.Kaupp, U.B., and Seifert, R. (2002). Cyclic nucleotide-gated ion channels. Physiol Rev 82, 769-824.

4.Li, M., Zhou, X., Wang, S., Michailidis, I., Gong, Y., Su, D., Li, H., Li, X., and Yang, J. (2017). Structure of a eukaryotic cyclic-nucleotide-gated channel. Nature 542, 60-65.

5.Zheng, X., Fu, Z., Su, D., Zhang, Y., Li, M., Pan, Y., Li, H., Li, S., Grassucci, R.A., Ren, Z., et al. (2020). Mechanism of ligand activation of a eukaryotic cyclic nucleotide-gated channel. Nat Struct Mol Biol 27, 625-634.