Mol Cell丨陈飞团队揭示真核生物转录机器在转录早期命运决定的机制

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基因表达的精准调控，对机体发育和细胞的各种生理功能的维持至关重要。基因表达的紊乱，则影响着众多的生理和病理过程。转录是基因表达调控最关键的步骤，因此转录调控机制的研究一直是分子生物学的核心课题。真核生物大多数基因的转录主要分为转录起始（initiation）、暂停（pausing）、延伸（elongation）和终止（termination）四个步骤，每个步骤都涉及到RNA聚合酶II（Pol II）与对应的转录起始因子、延伸因子或终止因子之间的相互作用和调控【1】。

Pol II在转录起始后延伸到20-100 bp后暂停的现象被称为启动子近端Pol II暂停，这是转录调控的核心；该区域的稳定主要依赖于negative elongation factor (NELF)，DRB sensitivity-inducing factor (DSIF)和Pol II-associated factor 1 (PAF1)等复合物来维持。暂停的Pol II在暂停之后，会在“有效的转录延伸（productive release）”和“早期终止 (early termination)”两种命运之间进行选择。当激酶复合物p-TEFb被招募到pausing位点后，它能磷酸化Pol II CTD、DSIF和NELF，使得NELF解离；随后暂停的Pol II被转录延伸因子DSIF等激活，从而进入高效的转录延伸阶段（productive elongation）。

 

2021年9月16日，复旦大学生物医学研究院陈飞课题组在Molecular Cell杂志上在线发表题为SPT5 stabilizes RNA polymerase II, orchestrates transcription cycles, and maintains the enhancer landscape的研究论文。该项研究利用诱导型蛋白降解系统dTAG并结合转录调控高通量研究方法，发现转录调控因子SPT5能够直接促进转录机器的蛋白质稳定性；在转录层面，SPT5能够调控增强子（enhancer）活性，稳定暂停的Pol II，并促进暂停Pol II的释放、转录延伸和转录终止。其中，SPT5第666位的丝氨酸（S666）的磷酸化特异性促进暂停Pol II的释放，而CTR1的磷酸化特异性调控转录终止。同时，这两个位点均能被磷酸酶INTAC去磷酸化，说明了SPT5介导的INTAC的功能。

ROTACs由靶蛋白配体、E3泛素连接酶配体和连接链三部分组成，该分子能分别识别靶蛋白和E3泛素连接酶来诱导靶蛋白的多聚泛素化，从而使靶蛋白能够被蛋白酶体识别并降解。dTAG是一种能将CRBN泛素连接酶和FKBP12F36V连接起来的新化合物，该系统只要将FKBP12F36V与目标蛋白融合就能实现对其快速且特异的降解【4】。

为了研究SPT5蛋白对基因转录直接的调控作用，该研究利用CRISPR-Cas9系统构建了FKBP12F36V-SPT5（SPT5-dTAG）细胞系，从而可以对内源SPT5蛋白进行动态调控。比较意外的是，随着SPT5蛋白的降解，RNA 聚合酶II最大的亚基RPB1蛋白也随之减少，并且RPB1 pSer5（与启动子暂停pausing相关）减少的量比RPB1 pSer2（与转录延伸相关）的大；用ChIP-Rx也验证了这一结果，说明细胞水平和染色质水平上的RPB1均减少。进一步研究发现RPB1蛋白的减少是通过泛素化降解途径进行的。

PRO-seq (Precision nuclear run-on sequencing)技术是以单个碱基的分辨率检测转录Pol II的定位和转录活性的高精度转录调控研究方法。利用PRO-seq技术分析SPT5蛋白快速降解的细胞系发现：1）基因启动子暂停的Pol II急剧减少，基本没看到pause release的想象；2）转录的持续性（processivity）显著降低；3）在基因转录终止的区域有明显的转录 “顺读”（transcription readthrough）。这些结果说明SPT5在维持暂停Pol II蛋白的稳定性、转录延伸和转录终止等方面有重要的调控作用。

增强子（enhancer）能通过在时空上精确的调控靶基因的表达。它的转录也依赖于Pol II，基于上述SPT5蛋白对mRNA基因转录的调控作用，促使研究人员去探究其对增强子转录活性的影响。通过ATAC-seq 分析发现 SPT5蛋白的缺失造成了约25%的增强子染色质的可及性（chromatin accessibility）显著下降。通过H3K27ac，MED1和BRG1（染色质重塑复合物BAF的催化亚基）的ChIP-Rx分析，它们在增强子上的信号也减弱。以上结果说明SPT5也能调控增强子的转录活性。

SPT5做为最保守的转录调节因子，激酶p-TEFb能催化SPT5 S666和CTR1位点的磷酸化。为了回答这两个修饰的对转录的调控作用，研究人员分别用这两个突变位点的SPT5蛋白（SPT5 S666A，SPT5 CTR1-T4A）做了回补实验。发现SPT5 S666A会使启动子区暂停Pol II（pausing）信号增强而基因内部Pol II信号减弱，提示SPT5 S666的磷酸化可能跟Pol II的释放（release）有关；SPT5 CTR1-T4A则让基因转录终止信号提前，说明SPT5 CTR1磷酸化与转录终止相关。有意思的是，这两个位点的磷酸化均能被磷酸酶INTAC去除，提示INTAC在转录暂停和转录终止这两个阶段发挥着重要的作用。

综上所述，SPT5蛋白分别从影响增强子的转录活性、Pol II蛋白的稳定性、转录暂停（pausing）、延伸（elongation）和终止（termination）等方面来调控转录核心机器的运转，为将来研究其生理病理的功能提供理论指导。

据悉，复旦大学附属肿瘤医院助理研究员胡士斌、博士后彭林娜和徐从玲为本文共同第一作者，博士生王振宁和宋爱霞对本文也有重要的贡献，陈飞为本文的通讯作者。TT-seq实验得到武汉大学梁凯威教授和王红红同学的帮助。

值得一提的是，近日美国西北大学Ali Shilatifard课题组在Molecular Cell杂志上在线发表题为SPT5 stabilization of promoter-proximal RNA polymerase II的研究论文。该研究解析了SPT5蛋白缺失后RPB1蛋白的降解机制，发现E3泛素连接酶CUL3和解折叠酶VCP是必需的。该研究与陈飞团队第一部分的发现一致。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.08.029

陈飞课题组依托复旦大学附属肿瘤医院和生物医学研究院，长期欢迎志同道合、热爱科研的朋友以科研助理、技术员或博士后方式加入课题组。联系方式：feixchen@fudan.edu.cn

 

课题组简介如下：

复旦大学陈飞课题组将依托复旦大学生物医学研究院和附属肿瘤医院，专注于转录和表观遗传调控在生理和疾病条件下的机制和功能研究。实验室主要利用高通量测序、生物化学、基因组学、表观遗传学和肿瘤生物学的手段，研究转录和表观遗传调控的分子调控机制，以及转录和表观遗传的失调在疾病尤其是肿瘤发生和转移中的功能，并探索新的分子治疗靶标和开发新的靶向治疗小分子药物。陈飞博士和博士后分别完成于美国西北大学医学院Ali Shilatifard实验室和Memorial Sloan Kettering Cancer Center的Joan Massague实验室，训练期间在Science和Cell等杂志发表第一作者文章7篇。2020年初在复旦大学建立课题组后，以通讯作者在Science和Molecular Cell上发表文章。课题组目前受到国家高层次人才青年项目、国自然基金委、复旦大学和复旦大学附属肿瘤医院等基金资助。

课题组主页：chenf-lab.fudan.edu.cn

参考文献

1.Chen, F.X., Smith, E.R. & Shilatifard, A. Born to run: control of transcription elongation by RNA polymerase II. Nat Rev Mol Cell Biol 19, 464-478 (2018).

2.Decker, T.M. Mechanisms of Transcription Elongation Factor DSIF (Spt4-Spt5). J Mol Biol, 166657 (2020).

3.Zheng, H. et al. Identification of Integrator-PP2A complex (INTAC), an RNA polymerase II phosphatase. Science 370, eabb5872 (2020).

4.Nabet, B. et al. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nat Chem Biol 14, 431-441 (2018).