文章来源：云起IVD、和义广业网

一、测序技术概述

测序技术指用于确定核酸、蛋白质、多糖等生物大分子的一级结构，较为常见的是核酸测序，确定核苷酸在核酸序列中的顺序，包括DNA和RNA测序，简单来说，就是将DNA/RNA分子中碱基ATGC的排列顺序显示出来。

测序技术的发展主要基于两个非常具有里程碑意义的理念：“生命是序列的”和“生命是数据的”，序列是基因组学最基本最重要的数据，也是生命科学领域大数据时代的核心组成部分。目前DNA测序已经从第一代DNA测序技术发展到第三代DNA测序技术，下文就DNA的三代测序技术进行简要说明。

（一）第一代测序技术

一代测序技术以Sanger发明的DNA双脱氧核苷酸末端终止测序法(chain terminator sequencing) [1]和A.M.Maxam和W.Gilbert报道的DNA化学降解测序法(chemical degradation sequencing)为代表[2]，但由于化学降解法的程序复杂，后来逐渐被Sanger测序法代替。

基于DNA合成反应的Sanger法，又称为SBS法、末端终止法，于1975年由Sanger提出，并于1977发表第一个完整的生物体基因组序列。其核心原理是由于双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP)的2、3位置不含羟基，在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键，因此可以被用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有效放射性同位素标记的某种ddNTP（分为：ddATP，ddCTP，ddGTP 和 ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列[3]。

图. 一代测序技术[4]

（二）第二代测序技术

20世纪90年代中期，第二代测序(next-generation sequencing，NGS)技术出现，随着NGS的发展出现了不同的二代测序平台。2005年，出现了第一个商用二代测序平台——454 Roche GS FLX[5]，该平台目前已经被淘汰；随后出现了Illumina（2006年）、SOLiD（2007 年）、Ion Torrent（2010 年）和华大基因的 BGISEQ （2013 年）。这些测序平台除了SOLiD是基于连接法测序 （sequence by ligation，SBL）外，其他平台都采用边合成边测序（sequence by synthesis，SBS）技术。

Illumina循环SBS法 (cycle SBS)也叫SBRT （Sequencing By Reversible Termination，可逆终止）的核心技术是DNA合成的可逆性末端循环，即3'-OH可逆性的修饰和去修饰。其基本原理是将dNTP的3'-OH以叠氮基团RTG （Reversible Terminating Group，可逆末端基团）进行修饰；将4种碱基分别与不同的荧光分子连接；DNA合成时，RTG能起到类似于ddNTP的作用终止反应；每次合成反应终止并读取信号之后，洗脱RTG和荧光分子，进行下一轮循环[6]（如下方视频所示）。