Cell | 基因治疗新突破——AAV衣壳变异体实现肌肉组织定向基因转导

撰文 | 言笑

替换或编辑致病突变为治疗人类疾病带来了巨大的希望。重组腺相关病毒 （Recombinant adeno-associated viruses, rAAVs ） 是目前基础研究和临床研究中首选的体内基因替代和基因编辑载体，然而，天然的AAVs并不专门针对病变的细胞和组织，因此，系统传递后对特定组织的选择性转导仍然是一个挑战。天然的AAVs在全身注射后会被大量隔离在肝脏中，这种隔离作用限制了其他器官的转导效率和治疗效果 【1】 ，尤其是一些大型组织，例如骨骼肌。肌肉组织大约占总体重的40%左右，若想采用天然AAVs衣壳变异体在肌肉中达到治疗效果，则需要注射极高病毒剂量 （大约2E+14 vg/kg） 【2】 。为了改进AAVs，合成生物学家采用了一种“定向进化” （Directed evolution） 的方法——随机改变构成病毒的外壳生成不同的衣壳库，然后在细胞培养或动物模型中选择具有理想取向的衣壳变异体，最终实现选择性地将基因传递到各种目标组织中。

2021年9月9日，来自美国布罗德研究所的Pardis C. Sabeti团队与哈佛大学的Amy J. Wagers团队合作，在Cell杂志在线发表了题为 Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species 的研究论文。 研究人员开发了一种体内策略来定向进化和筛选AAVs衣壳变异体，并成功地进化出了一组含有RGD基序（RGD-motif）的AAV衣壳变异体，能够高效地将基因传递至小鼠或人肌肉组织中。机制和功能探究表明，这些AAV衣壳变异体主要依赖于整合素异二聚体发挥其转导功能，并能够在低剂量全身给药后对肌营养不良症实现明显的治疗效果。

首先，作者开发了DELIVER策略 （利用转基因 RNA 的体内表达定向进化AAV衣壳） 将多样化的衣壳文库生成与严格的基于转录本的体内选择相结合，实现定向进化，然后在任何感兴趣的组织和动物模型中鉴定功能性衣壳变体。如图1所示，每个变体都包括一个随机的7聚体肽 （7-mer peptide） ，插入到AAV9衣壳高变区VIII的第588位和596位氨基酸之间，这种设计可确保可变肽序列暴露在衣壳表面；每个变体还包含了在广谱性或细胞类型特异性启动子控制下的编码自身衣壳的基因序列，使得衣壳变体可以在HEK293细胞和动物组织中表达。

图1. 利用DELIVER技术生产病毒库和衣壳变异选择的示意图

作者通过定向进化进行了两轮体内筛选，在C57BL/6J小鼠的多种不同肌肉组织中筛选出了由MHCK7启动子表达的衣壳变异体：病毒库测序分析确定了超过 5,000,000个独特的衣壳变体，通过第一轮筛选之后，选出了在7种肌肉组织 （股四头肌、胫前肌、腓肠肌、三头肌、腹部、膈肌和心脏） 中高度表达的前30,000 个变异体；在第二轮筛选中，作者引入了同义密码子对照和启动子对照 （骨骼肌特异性启动子CK8或MHCK7） ，发现来自CK8或MHCK7文库在肌肉中高度表达的前12种衣壳变体在7聚体插入片段的前三个氨基酸位置包含相同的RGD基序。最后，研究人员筛选出了包含RGDLTTP肽插入的变体进行进一步的功能探究和分析，并将该变体命名为“MyoAAV 1A”。

为了研究全身给药后MyoAAV 1A的转导谱和生物分布，作者给成年C57BL/6J 小鼠注射了1E+12 vg （约4E+13 vg/kg） AAV9-或MyoAAV 1A-CMV-EGFP，并在注射2周后分析不同组织中的转基因表达和载体基因组丰度。组织免疫荧光检测显示，与注射AAV9的小鼠相比较，注射了MyoAAV 1A的小鼠肌肉中的荧光强度更高；MyoAAV 1A注射小鼠肌肉纤维和心肌细胞中的转基因高表达；同时，MyoAAV 1A肝脏转导相对减少。通过对小鼠不同骨骼肌中EGFP mRNA的定量分析发现，与注射AAV9的小鼠相比，注射MyoAAV 1A的肌肉中转基因表达高 10至29倍；在注射了MyoAAV 1A的心脏组织中，EGFP mRNA表达量高6.3倍，肝脏中低2.8倍；值得注意的是，MyoAAV 1A 提高的转导效率仅限于横纹肌组织，与AAV9相比，这种改造的衣壳变体以相似或更低的效率转导了注射动物的肺、肾、脾和脑。这些结果说明全身给药后，MyoAAV 1A可以特异性地高效地转导小鼠肌肉组织。

随后，研究人员探究了MyoAAV 1A体内递送治疗性转基因的可行性。Dystrophin -deficient mdx小鼠是假肥大性肌营养不良症 （Duchenne muscular dystrophy，DMD） 的遗传模型 （在 Dmd外显子23中携带无义突变） 。之前已有研究表明，通过CRISPR-Cas9介导的方法从mdx细胞的基因组中切除外显子23同时表达功能性dystrophin，有益于治疗肌营养不良 【3-4】 。研究人员向成年mdx小鼠注射AAV9或MyoAAV 1A携带编码SaCas9的构建体 （AAV9-Dmd CRISPR和MyoAAV 1A-Dmd CRISPR） ，以及靶向mdx突变的5’和3’端的引导RNA (gRNAs) 。免疫荧光和蛋白质印迹分析证实，与AAV9-Dmd CRISPR相比，注射了MyoAAV 1A-Dmd CRISPR的小鼠肌肉中dystrophin的恢复更显著、更广泛。对AAV-CRISPR治疗的动物胫骨前肌 （tibialis anterior，TA） 进行的生理学评估表明，MyoAAV 1A-Dmd CRISPR注射的mdx小鼠的各项肌肉功能指标均优于对照组，说明与AAV9相比，MyoAAV 1A 表现出显著增强的将治疗性基因编辑复合物递送至肌肉组织的效力。MyoAAV 1A的基因置换能力在X-连锁肌管肌病 （X-linked myotubular myopathy, XLMTM） 小鼠模型中得到了进一步的验证。

那么MyoAAV 1A实现肌肉定向转导的分子机制是什么？由于MyoAAV 1A和其他筛选出来的衣壳变体中均存在RGD基序，因此，作者推测RGD结合整合素异二聚体可能在MyoAAV 1A转导中具有重要作用。研究人员在HEK293细胞中转染了编码8种人GRD结合整联蛋白异二聚体的质粒 （aIIbb3, a5b1, a8b1, aVb1, aVb3, aVb5, aVb6和aVb8） ，然后比较这些HEK293细胞中MyoAAV 1A-CMV-Nluc的转导效率。结果显示，过表达a8b1, aVb1, aVb3, aVb6或aVb8可以显著增强MyoAAV 1A-CMV-Nluc的转导效率。两种不同的pan-aV整合素拮抗剂 （CWHM-12 和 GLPG-0187） 均可以以剂量依赖性方式阻碍小鼠和人原发性骨骼肌肌管中的MyoAAV 1A转导，而对AAV9 转导效率无明显影响。进一步分析发现，在具有促进MyoAAV 1A转导能力的含有aV的整联蛋白异二聚体中，aVb6具有最强的与衣壳变体结合的亲和力。此外，aVb6必须存在于人肌肉细胞的表面，才能使得MyoAAV 1A实现最佳转导。

在后续的研究工作中，作者使用DELIVER策略进行了进一步的体内进化筛选，并获得了第二代 RGD-变异体，MyoAAV 2A。功能探究显示，全身低剂量注射病毒后，MyoAAV 2A具有比MyoAAV 1A更明显的治疗潜力。

总的来说，该研究清楚阐释了一个跨物种的高效肌肉定向AAV衣壳变体家族的进化、改良和表征，并在多个遗传性肌肉疾病小鼠模型中证明了这些载体的治疗功效。研究人员认为， 这些载体的开发有利于推进肌肉骨骼疾病的肌肉定向治疗基因传递。同时，本研究中开发的DELIVER系统提供了一个高度适应性的平台，可用于筛选靶向体内任何组织或细胞类型的AAV衣壳变体 ，极大地扩展了该载体系统跨领域和学科的临床和实验应用。 最后，作者希望在其他组织和器官中采用DELIVER系统可以加速人类疾病基因治疗和其他基因组医学方法的开发和转化。

原文链接:

https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.08.028

制版人：十一

参考文献

[1] Murrey, D.A., Naughton, B.J., Duncan, F.J., et al. (2014). Hum. Gene Ther. Clin. Dev. 25, 72–84.

[2] Duan, D. (2018). Mol. Ther. 26, 2337–2356.

[3] Nelson, C.E., Hakim, C.H., Ousterout, D.G., et al. (2016). Science 351, 403–407.

[4] Tabebordbar, M., Zhu, K., Cheng, J.K.W., et al. (2016). Science 351, 407–411.

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