Nat Chem Biol背靠背 丨董城/闵金荣/宓文义、许超分别揭示CRL2泛素连接酶受体蛋白识别C端降解子的分子机制

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生物机体通过一系列精确的合成与降解调控机制维护体内蛋白质的动态平衡。蛋白出现损伤或错误折叠时，将被泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-proteasome system, UPS）及时的降解和清除，从而维持细胞的正常生理功能（2004年诺贝尔化学奖）。泛素-蛋白酶体系统功能异常导致生理状态下蛋白稳态失衡，引起癌症、阿尔茨海默症、帕金森病、亨廷顿氏病、早衰等多种疾病的产生。

在泛素-蛋白酶体负责的蛋白降解过程中，经过泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的一系列级联反应将底物作上泛素标记，使其能够被蛋白酶体识别并降解。在探索泛素-蛋白酶体降解底物特异性过程中，Alexander Varshavsky实验室发现了一条重要的蛋白降解规律，被称作“N端规则”（N-end rule），即蛋白质的半衰期取决于其N端氨基酸残基的种类和特性，特定的N端氨基酸残基会被特定的连接酶E3识别，从而被泛素化标记和降解。最近，具有这类性质的N端残基被赋予“N端降解子”（N-end degron）的名称。有意思的是，2018年Stephen J. Elledges实验室和Hsueh-Chi S. Yen实验室都发现，蛋白的C端氨基酸残基也可以作为降解信号肽被特异的连接酶E3识别，导致其降解。与N端残基相对应，命名为“C端降解子”（C-end degron）。“N端降解子”和“C端降解子”都可以被人体内特异的连接酶E3所识别，其中“N端降解子”对应的同源E3连接酶及其识别机制已经得到了广泛的研究，而对“C端降解子”同源E3连接酶及其识别机制的研究处于刚刚起步阶段。

2020年1月4日，来自天津医科大学的董城课题组、宓文义课题组和加拿大多伦多大学闵金荣课题组一起合作，同时来自中国科学技术大学许超课题组和以色列-巴伊兰大学Itay Koren课题组一起合作背靠背在Nature Chemical Biology同时在线发表了题为Molecular basis for ubiquitin ligase CRL2^FEM1C-mediated recognition of C-degron和Molecular basis for arginine C-terminal degron recognition by Cul2^FEM1 E3 ligase的论文，分别对CRL2泛素连接酶受体蛋白质FEM1A、FEM1B、FEM1C识别“C端降解子”的分子机制进行了深入研究，通过解析人源FEM1C及其同源蛋白与其特异性识别的精氨酸C末端降解子（Arg/C-end degron）的高分辨复合物晶体结构，利用体外生化分析、细胞内蛋白稳定性分析（GPS）等技术手段，系统性地揭示了FEM1A/C和FEM1B选择性识别不同类别的Arg/C-end degron的分子机制，为靶向FEM1C及其同源蛋白的小分子抑制剂筛选提供了结构基础，同时也为FEM1A/B/C可能成为PROTAC泛素连接酶E3工具库的一员提供了理论基础。

在Molecular basis for ubiquitin ligase CRL2^FEM1C-mediated recognition of C-degron论文中，作者首先解析了FEM1C截短突变体的单体结构，解析过程中意外的发现，FEM1C截短突变体的C末端精氨酸被另外一个同样的截短突变体识别，成为另一个单体的识别底物，形成一个不对称的二体形式，从而鉴定出了识别Arg/C-end degron的功能结构域。接着，作者又解析了FEM1C与I型人类免疫缺陷病毒REV蛋白小肽共结晶复合体，得到2.0-2.5 Å高分辨率晶体结构，进一步证实FEM1C主要通过酸性的结合口袋与底物Arg/C-end degron相互作用。另外，FEM1C还能够通过正电离子-π相互作用更加稳定其与Arg/C-end degron的相互作用。在对底物序列偏好性方面的研究中发现，除了C末端精氨酸在FEM1C识别过程中发挥了主导作用外，倒数第三位也偏好结合带正电的精氨酸。其次，在细胞内利用基于双荧光报告质粒的蛋白稳定性检测系统（GPS）证实了FEM1C识别Arg/C-end degron分子机制的正确性。最后，通过对FEM1A、FEM1B和FEM1C序列同源性分析，找出三者识别含有C末端精氨酸不同序列降解子差异性的原因。

在Molecular basis for arginine C-terminal degron recognition by Cul2^FEM1 E3 ligase论文中，作者先通过等温量热滴定法 (ITC) 结合实验发现，FEM1A/B/C蛋白质均通过氨基端的锚蛋白重复结构域 (ankyrin repeats) 识别Arg/C-end degron， FEM1A和FEM1C对C末端精氨酸前面的氨基酸序列选择性相同，但FEM1B表现出了不同的序列偏好性。继而，分别解析了FEM1C与来自SIL1、NS11、OR51B2、Clone13四种蛋白Arg/C-end degron肽段的复合物晶体结构，四个复合物晶体结构分析发现，FEM1C通过双位点模式，即两个间隔的带负电的口袋 (p1和p2)，分别识别末端精氨酸及其上游的碱性氨基酸，识别序列表示为-K/R-X1-2-R，其中X表示任意氨基酸。为了理解FEM1C和FEM1B识别序列选择性差异，作者还一步解析了FEM1B和CDK5R1 C-end degron的复合物晶体结构。通过比较FEM1B与FEM1C两种复合物结构，发现FEM1C与FEM1B底物选择性差异源于它们各自组成p2口袋的氨基酸不同。为了验证这一点，他们将FEM1C p2口袋的三个氨基酸残基均突变为FEM1B的对应残基，发现突变后的FEM1C在底物选择性上非常接近FEM1B，完成了底物选择从-K-X-X-R（SIL1）序列向 -G-L-X-R（CDK5R1）的转化。最后，在哺乳动物细胞中构建基于双荧光的蛋白质稳定性报告质粒系统 (GPS)，通过体内实验验证了Cul2^FEM1 通过识别蛋白质Arg/C-end degron可以有效调控蛋白质泛素化降解过程。同时，基于Cul2^FEM1对底物识别选择性差异，鉴定出了20多个潜在受Cul2^FEM1调控的新底物。

上面一篇文章的第一作者为天津医科大学基础医学院的讲师闫晓洁和宓文义课题组的王晓璐，董城教授、宓文义教授和多伦多大学闵金荣教授为共同通讯作者。

下面一篇文章的第一作者为许超教授课题组博士生陈新颜、特任副研究员廖善晖、Itay Koren课题组的Yaara Makaros，许超教授、Itay Koren教授为共同通讯作者。

附：宓文义教授课题组和董城教授课题组现公开招聘教师岗工作人员（正式编制）及实验技术人员，欢迎投递简历至wenyi.mi@tmu.edu.cn/dongcheng@tmu.edu.cn。