Science | James Letts/周龙合作揭示四膜虫氧化磷酸化复合体结构与功能的高度特异性

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关键词： Science揭示合作

资讯来源：BioArt

发布时间： 2022-04-02

责编｜酶美

氧化磷酸化是所有自由生活的真核生物获取能量的主要方式，位于线粒体内膜上的电子传递链（Electron transport chain, ETC）复合体I-IV负责将还原性代谢产物（NADH、琥珀酸等）的电子传递给终末受体分子氧，而ATP合成酶则将释放出的能量转换为“通用货币”ATP。目前针对真核ETC复合体的结构研究主要集中于解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）【1】及各种哺乳类物种【2-4】，而它们在真核演进中同属于后鞭毛演化支（Opisthokonta）。近期多个课题组分别解析了藻类【5】与高等维管植物【6, 7】复合体I结构，揭示了泛植物演化支（Archaeplastida）ETC复合体的结构特异性。对于其他真核生物，虽然已有针对ATP合成酶的研究表明了其结构组成，多聚形态与线粒体内膜嵴形态的多样性【8, 9】，但ETC复合体的结构则尚属空白。

2022年3月31日，美国加州大学戴维斯分校分子与细胞生物学系的James Letts（通讯作者）团队与浙江大学医学院的周龙研究员（第一作者）团队合作在Science期刊以Research Article的形式发表了题为 Structures of Tetrahymena ’s respiratory chain reveal the diversity of eukaryotic core metabolism 的研究论文，解析了纤毛纲重要模式生物嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila, Tt）超复合体I-III₂（Supercomplex I+III₂, SC I+III₂）及复合体IV二聚体（CIV₂）分别2.6Å与3.0Å的冷冻电镜结构。其中SC I+III₂分子量达到2.3 MDa，由91个亚基组成，相比较下哺乳类SC I+III₂分子量仅1.4 MDa，67个亚基。四膜虫CIV₂分子量更是达到2.7 MDa，每单体由52个亚基组成，远超10-14亚基，约200 kDa的酵母、植物与哺乳类复合体IV单体，同时也超过四膜虫自身的SC I+III₂成为其最大ETC复合体，打破了复合体I是ETC中最大膜蛋白的传统认知。

本研究发现嗜热四膜虫复合体I不完全符合后鞭毛类14核心亚基的布局：其膜内负责辅酶Q（Co-enzyme Q, CoQ）结合与跨膜质子转运的三个亚基ND1，ND2，ND5均分裂成A、B两个亚基。同时，其复合体I拥有51个附属亚基，其中20个亚基在现有各物种复合体I结构中并无同源，为本研究首次发现。特别值得注意的是，与哺乳类不同，四膜虫复合体I并不存在“激活-失活”两种功能状态的转变，结构上也没有膜内外两臂夹角改变导致的“开放-闭合”两种构象。对于这种持续激活的复合体I，其CoQ通道附近对底物回转有重要意义的几个环区（ND3 TMH 1-2, NDUFS7 loop, NDUFS2 1-2 loop, ND6 TMH 3-4, ND1 TMH 5-6）均与 “闭合”构象的哺乳类复合体I一致。这提示“开放-闭合” 的构象转变或许并不属于真核复合体I普遍保守的催化机制的一部分，也为长期激烈争论的复合体I工作机理的研究提供了新思路【10, 11】。

四膜虫SC I+III₂新增的附属亚基加强了复合体I与复合体III₂间的结合，在线粒体基质侧（3个），内膜中（1个）及膜间质侧（1个）共有5个结合界面，共同造成了二者在基质侧的远离和在膜间质侧的靠近，使得SC I+III₂膜内部分整体适应四膜虫存在平滑弧度的嵴形态。这种高度紧密的结合使得四膜虫SC I+III₂实际上成为“强制超复合体”，即没有单独的复合体I存在。值得注意的是，复合体I-III₂的融合导致后者两个单体间发生对称性破坏，表现为在复合体III₂的“醌循环”机制中，远离复合体I的单体因空间位阻而无法氧化CoQ；且因为两单体的血红素b_L间距增加到14 Å而使得该单体也无法从另一单体获得电子来还原CoQ。四膜虫SC I+III₂中复合体III₂的对称性破坏是现有各物种的结构中最为显著的【12】，提示高度保守的超复合体SC I+III₂形成的生理意义，在于通过分化复合体III₂两个“醌口袋”的氧化与还原功能来调控两复合体间反应速率的耦合。

四膜虫ETC复合体的高度特异性集中体现在其复合体IV上。早期研究因四膜虫线粒体可还原但无法氧化哺乳类细胞色素c而推断四膜虫没有复合体IV，代之以某种独特的ETC末端氧化酶【13】。本研究解析的CIV₂结构分子量巨大，且整体外形与哺乳类复合体IV二聚体晶体结构存在很大区别。除三个核心亚基（COX1-3）与6个在其他物种中存在同源的亚基外，另有44个附属亚基为本研究首次发现。值得注意的是，四膜虫CIV₂表面的细胞色素c结合位点被其特有亚基与结构围成一个“深坑”，且与自身细胞色素c结合界面的表面电势相较于哺乳类发生正负反转，故而致使物种间电子传递无法完成。

另一方面，四膜虫CIV₂内部存在一个约2610⁴ Å³，推测充满磷脂分子的巨大空穴，提示其强制二聚机制与蛋白-磷脂互作有关。在其大量附属亚基中，存在三个位于外周的SLC25A家族线粒体转运蛋白COXMC1-3。其中COXMC1-2形成异源二聚体，COXMC2经序列与关键残基比对可基本确定为-酮戊二酸转运蛋白SLC25A11，而COXMC1通过将N端环区伸入COXMC2内部，对其转运功能发挥可能的调节作用。三个转运蛋白与四膜虫CIV₂的结合推测与ETC-SLC25A的膜电势耦合有关。同时，四膜虫CIV₂细胞色素c“深坑”附近结合了一个来自线粒体内外膜转运系统（Translocase of the inner/outer membrane, TIM/TOM）的，类似六聚TIM8/9/10/12分子伴侣的六聚-螺旋桨结构。这类分子伴侣有TIM9₃-TIM10₃，TIM8₃-TIM13₃，或者与TIM22复合体结合的TIM9₃-TIM10₂-TIM12等几种形式，此处与CIV₂结合推测与其装配过程或线粒体氧化还原稳态调控相关。

这项研究的特色在于，从一个经典模式生物入手，在结构、功能、调控等多个层面密集地打破了电子传递链复合体的现有范式，拓展了对该领域多样化可能性的理解，为其研究注入了新的活力。一位匿名评审专家在审稿意见中说：“对我而言，阅读这份稿件确实是一次瞠目结舌的体验（Reading the manuscript for me was truly a jaw-dropping experience）”。另外，本研究使用了从一套单颗粒数据中同时解析几个复合体结构；以及在没有序列信息的前提下，完全依靠电子密度与有限注释的蛋白质组进行从头建模等冷冻电镜技术，被另一位匿名评审专家评论为“报道了令人印象深刻的大量新结构信息，并展现了冷冻电镜技术的能力所在（The manuscript reports an impressive amount of new structural information and demonstrates the power of cryoEM）”。

James Letts博士是本文的通讯作者，周龙博士与María Maldonado博士是本文共同第一作者，参与合作的还有UCD Abhilash Padavannil博士与电镜平台主任郭飞博士。周龙博士已全职回到浙江大学医学院生物物理系任百人计划研究员，并致力于氧化磷酸化复合体结构多样性，精细工作机制及其他线粒体相关重要分子机器的研究工作，主要研究成果发表于Science，Blood，NSMB，eLife等期刊，先面向海内外公开招聘博士后研究人员1-2名。

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原文链接：

http://doi.org/10.1126/science.abn7747

制版人：十一

参考文献

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2. K. Fiedorczuk et al., Atomic structure of the entire mammalian mitochondrial complex I. Nature. 538, 406–410 (2016).

3. M. Wu, J. Gu, R. Guo, Y. Huang, M. Yang, Structure of Mammalian Respiratory Supercomplex I1III2IV1. Cell. 167, 1598-1609.e10 (2016).

4. J. Zhu, K. R. Vinothkumar, J. Hirst, Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536, 354–358 (2016).

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8. R. K. Flygaard, A. Mühleip, V. Tobiasson, A. Amunts, Type III ATP synthase is a symmetry-deviated dimer that induces membrane curvature through tetramerization. Nature communications. 11, 5342 (2020).

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10. D. Kampjut, L. A. Sazanov, The coupling mechanism of mammalian respiratory complex I. Science (New York, N.Y.). 370 (2020), doi:10.1126/science.abc4209.

11. J. Gu, T. Liu, R. Guo, L. Zhang, M. Yang, The coupling mechanism of mammalian mitochondrial complex I. Nature structural & molecular biology. 29, 172–182 (2022).

12. J. A. Letts, K. Fiedorczuk, G. Degliesposti, M. Skehel, L. A. Sazanov, Structures of Respiratory Supercomplex I+III2 Reveal Functional and Conformational Crosstalk. Molecular cell. 75, 1131-1146.e6 (2019).

13. H. J. EICHEL, Respiratory enzyme studies in tetrahymena pyriformis. II. Reduced diphosphopyridine nucleotide oxidase and reduced diphosphopyridine nucleotide cytochrome c reductase. The Journal of biological chemistry. 222, 121–36 (1956).

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