以疫苗为例，回顾加速纯化工艺开发的最新策略进展：高通量和人工智能

混合工艺开发方法结合实验和建模工具来设计工艺。在引入LHS 之后，混合方法获得了行业特别的兴趣，因为LHS 能够以高通量方式进行实验。在工艺设计中使用HTE 称为 HTPD，将 HTS 与经验或机械建模相结合称为基于模型的HTPD。HTPD的实施在工艺和产品理解方面追求 QbD 范式，因此有助于实现高且稳定的产品质量以及工艺稳健性。HTPD大约在 15 年前出现，并从那时起作为一种高效且具有成本效益的方法得到了行业的广泛认可。基于模型的HTPD可应用于不同的开发阶段和不同的目的，如填料和溶解度筛选、设计空间定义、风险评估、工艺稳健性和控制。在Baumann 和 Hubbuch 的文章中，介绍了可在上游和下游工艺开发中使用的多种商业微型化高通量系统。Lacki的技术评论概述了最常用的层析高通量设备，例如微量过滤板、预装移液器吸头以及RoboColumn®（Repligen），后者目前的体积范围为50-600 μL。在这里，将讨论来自学术和工业研究人员的 HTPD 工作。可以在表 2 中找到有关这些和其它HTPD 方法的更多详细信息。根据研究的目的，不同的HTDP 方法有不同的适用性水平，例如填料筛选通常与经验模型一起使用，而机械建模则更适合包括多个纯化步骤的整体工艺设计。

表2.使用高通量和/或建模技术而已经被应用于工业和/或学术界的HTPD方法概述。

Bhambure 和Rathore 证明结合DoE，使用 HTPD 平台（2 和 6 μL 填料体积）相对于传统实验室规模（0.5 mL 填料体积）定义离子交换层析步骤的表征空间可显著提高生产力（高 170 倍）。Welsh 等人开发了一个更实用和通用的HTPD 工作流程，涉及高通量层析技术的多步方法，作为定义操作空间的指南。没有实施详细的建模工具，因为准确的性能预测不是目标，仅使用等温线模型来回归分配系数和最大化结合载量。Weigel等人应用了与 Welsh 等人类似的方法，研究疏水作用层析(HIC) 作为细胞培养源性甲型和乙型流感病毒最终纯化步骤的有效性。96孔滤板实验用于筛选各种填料和盐浓度，然后使用常规实验室规模的层析柱进行动态结合载量表征。然而，选择合理的逐步方法而不是数学建模的主要原因是HIC 缺乏可用的病毒纯化数据来确定模型参数。由于疫苗平台工艺几乎不可用，LaddEffio 等人采用捕获步骤，作为病毒样颗粒(VLP) 通用纯化平台工艺的第一部分，他们通过利用高通量实验和机械建模来实现计算机优化目的，以利用阴离子交换膜捕获步骤从复杂的VLP 原液中一步去除 HCP 和 DNA。尽管膜层析的平衡和结合载量通常是有限的，但在高流速下，膜层析在生产力以及保留时间方面优于传统的填充床层析，后者有利于提高柱床的利用率。预计在不久的将来，将有具有更高结合载量的可用膜材料，因此可以克服单位体积填料表面积的限制。膜层析技术的进步对生物制药行业来说绝对是有趣的发展方向。

尽管层析法是生物制药和疫苗的主要纯化技术之一，但其它下游工艺也适用高通量技术。沉淀是一种众所周知的、分离所需成分（如蛋白质、DNA或病毒）的技术，并被证明适合高通量。这种分离技术依赖于沉淀剂（例如氯化钙、硫酸铵或PEG）与一种或几种组分之间的物理和/或化学相互作用，其中溶解度是最关键的热力学性质。水性两相系统 (ATP) 也可以替代层析法，因为它基于液-液萃取，采用两个不混溶的相从混合物中分离组分。高通量技术与统计或数学/热力学模型相结合是表征这些系统的便捷方法。

监控过程的分析与纯化技术本身一样重要。然而，分析仍然是高通量实验期间的瓶颈，因此会大大减慢实验速度。Konstantinidis等人提供了一种策略性分析部署方法，有助于选择适当的分析技术，同时保持数据质量。尽管如此，找到加快分析通量的创新方法将具有很大的价值。

上一段中描述的研究主要集中在将 HTPD 应用于一个或两个连续的纯化步骤，但并未考虑整个纯化工作流程。通过单独优化每个单元操作来设计下游工艺可能会导致工艺设计欠佳，因为单个单元操作中的微小变化可能会影响后续纯化步骤的性能。很少有人研究针对一系列单元操作的高通量和基于模型的优化方法的组合。Nfor等人建立了一种系统的方法来合理地定义蛋白质纯化工艺，其利用自上而下的方法。通过流程图选择，在每个树形图级别消除了最没有希望的步骤，目的是保持最少数量的纯化单元。Huuk等人提出同时进行两步离子交换层析工艺优化，包括用于馏分收集的盐梯度和切割点，而不是顺序优化，这可能会产生次优工艺。Pirrung等人甚至证明了同时优化由三个层析步骤（例如阳离子交换、疏水相互作用和混合模式）组成的集成工艺的可行性，包括应用于复杂生物药进样纯化的中间缓冲液置换步骤（例如超滤和洗滤）。首先，利用高通量技术获得等温线参数，如先前的工作中更详细说明的那样，因此其它参数是通过传统的实验室规模实验获得的。使用ANN 寻找合适的起始条件，以使用机械模型进行局部优化，从而可以规避速度限制。这些用于优化整体下游工艺的例子需要建模和实验方法的综合组合。如果建立更多高效结合所有可用技术（例如LHS、建模、分析和数据处理工具）的 HTPD 方法，这种优化策略可能会变得更加有趣。

在引入高通量技术后，人们对 HTPD 的兴趣提高了，其主要好处是可以在消耗更少材料的同时生成更多数据。尽管如此，这些新兴技术仍面临许多障碍。实验性地将每项内容（包括分析）转移到高通量模式仍然是一个负担，尽管正在生成更多数据，但有效地处理和操作这些数据仍然具有挑战性。建模是缩小这一差距的有前途的工具。下一段将讨论建模的进一步改进。

虽然复杂的机械模型试图描述机制和热力学现象，但确定某些参数相当困难。简化模型可以避免某些困难，但是，过度简化可能会导致不准确的预测和无意义的结果。最佳模型应尽可能简单，同时仍能获得高度或充分的理解。此外，必须在准确性与速度之间进行权衡，尤其是在运行优化时。这导致了这个问题；如何减少计算时间或简化复杂模型，同时保持相似水平的准确性和/或细节。

人工神经网络（ANN） 在 90 年代后期已经被用于预测化学色谱中的保留时间。由于近年来产生了更大的数据集和更好的计算机系统，人工智能的使用在各个技术领域得到了普及，在生物技术领域也是如此。1992 年，Psichogios 和 Ungar提出了第一个用于模拟补料分批生物反应器的混合神经网络优先原理方法。这种混合模型使用神经网络模型来估计未知过程参数，作为第一原理模型的输入，从而提高了内插和外推能力，并在仅有“黑盒”神经网络的基础上加强了理解。VonStosch等人广泛回顾了混合半参数建模框架以及生物化学工程中有关过程监测、控制、优化、模型缩减和放大的各种应用。Nagrath等人使用串行白盒和黑盒配置（图 4）建立了一个优化框架，以找到适用于二元和三元混合物的层析工艺的最佳设计。在通过实验获得物理模型参数后，使用物理模型（即白盒）在各种条件下进行了大量模拟，以训练神经网络。最后，通过使用神经网络加速计算，确定了多个纯度水平的最佳操作条件。

同样，Pirrung 等人使用人工神经网络来加速由三个层析和 UF/DF 单元组成的工艺的优化。然而，在这里，人工神经网络被用来在全局优化期间找到足够的起始条件，以用于局部优化，这是与机械模型一起执行的，以确保获得真实和准确的结果。与仅使用机械模型进行优化相比，包括网络训练在内，速度提高了70%。降低计算成本是后两个例子（Nagrath 等人和 Pirrung 等人的研究）的主要目标，因此使用人工神经网络是有利的。然而，数据驱动的模型，取决于机械模型的准确性，因此限制了人工神经网络的预测能力。最近，Nikita等人展示了一种利用强化学习 (RL) 在连续层析工艺优化期间提高计算效率的新方法。每个机械模型模拟都根据RL 方法获得“奖励”，因此调整优化标准（设计空间）以加速优化的收敛。与传统的试错法相比，使用基于RL 的优化方法时，发现与产量和纯度要求直接相关的最佳流速的时间可加快3倍。然而，开发这种 RL 方法需要对RL 原理和机械建模有透彻的理解。除了使用混合半参数建模来优化意图之外，其它研究表明了黑盒建模在估计某些难以确定的白盒模型参数方面的有用性。

Wang等人使用神经网络从实验色谱图中直接推导出传质、等温线和特征性电荷参数，然后将这些参数作为机械模型的输入。通过这种方式，规避了用于确定这些参数的、耗时的实验方法。然而，这种方法仍然需要大量的实验。在机械过滤模型中，通量是一个关键参数，但准确预测该参数可能相当复杂。因此Krippl 等人使用人工神经网络来确定通量，使用跨膜压、错流速度和浓度作为输入参数。将混合模型串联放置，能够实现提前多步的浓度变化预测。一般来说，数据驱动模型与白盒模型相结合在预测准确性、计算和模型开发效率以及增强的外推特性方面具有优势。

着眼于未来，混合建模方法有望在工业界和学术界得到更多应用。为了实现这一前景，需要更多的建模专家来开发和维护这些软件应用程序。此外，高通量工艺开发（HTPD）中使用的建模技术也可用于后期开发阶段以及生产过程中的过程控制和优化。领先一步的是工业4.0，它被称为最新的革命，旨在实现整个生产过程的数字化。从过程控制到决策，所有监控数据都得到有效收集，这反过来对工艺开发也很有价值。为了实现工业4.0，数字孪生非常重要，其被定义为物理过程的虚拟对应物及其互连。

疫苗接种可以保护数百万人免受传染病的侵害，而且由于高产品质量是关键，下游工艺至关重要。生产中的下游工艺操作对产品上市时间、产品质量和商品成本有直接影响。因此，使开发工艺的策略现代化可能具有很大的价值。缩短疫苗工艺开发时间线的倡议已经提出，并且需要更深入地理解工艺，如质量源于设计指南所述。

高通量技术的引入加速了实验数据的生成，并允许更彻底和系统地研究参数的影响。然而，高通量还需要增强数据处理和建模技术。机械模型提供了对单元操作内部工作机制的见解，近年来越来越多地被工业界采用，证明它们增加了更深入的过程理解和更大的应用可能性。高通量和建模技术的结合推动了HTPD 方法，以更有效和更有目的的方式获取和使用数据，从而也实现了标准化的工艺开发方法。工艺开发的未来方向是在计算机上设计和优化整个下游工艺，只需要有限数量的模型校准和验证实验。混合（半参数）建模可以通过优化使用机械模型和数据驱动模型来帮助简化模型开发或提高准确性。最近的研究表明，除了机械模型之外，人工神经网络在规避计算速度限制或参数估计方面具有潜力。

借助这些新兴的新技术，现在可以标准化工艺开发工作流程，前提是使用实验和建模技术的熟练组合。创建通用工艺开发工作流程将缩短工艺开发时间，并在不同部门和生产站点之间共享知识。

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原文：D.Keulen, G.Geldhof, O.L.Bussy, et al., Recent advances to accelerate purification process development: a review with a focus on vaccines. Journal of Chromatography A, 2022, https://doi.org/10.1016/j.chroma.2022.463195.