阅尔基因在Nucleic Acids Research发表MSI研究最新成果并发布相关产品

主要研究内容

人类基因组微卫星的主要类型是单核苷酸微卫星（mononucleotides microsatellites），具有高丰度及高突变性，可作为疾病预测、诊断、预后和法医鉴定的生物标志物，在临床和法医学领域有重要应用。当DNA损伤修复系统出现问题可导致基因超突变性，有可能产生微卫星不稳定状态（MSI），同时伴随着串联重复序列数量的增多或减少。

MSI是一种基因组不稳定状态，不仅是肿瘤的分子表型，同时也是肿瘤的重要诱发因素。已有研究表明，MSI约发生在15%的结直肠癌以及30%的子宫内膜癌患者中。通常存在MSI的肿瘤患者生存率普遍更高，对PD-1等免疫检查点抑制剂的治疗响应也更好。由于串联重复序列的化学和物理学性质较难预测，使用传统的基于qPCR的检测方法难度较大。阅尔基因研究团队通过构建并验证DNA微卫星的链结合热力学模型，突破了高灵敏度检测MSI的技术瓶颈，开发了临床应用级别的MSI检测产品。

微卫星序列的自发突变可以由一种结构简并的特殊凸起结构触发。这种结构产生于DNA链复制过程中的滑动错误，在杂交探针或PCR引物结合到包含突变的微卫星序列上时也可能出现。为了区别其他静态类型的突起，我们称之为“滑动突起”（sliding bulge）。对滑动突起的研究有助于设计高质量探针引物，同时更深入探究MSI的产生机制以及MSI作为分子标志物的更多潜在价值。

虽然该“滑动凸起”结构在肿瘤基因组和神经系统疾病的研究中至关重要，但一方面由于微卫星可变的长度导致滑动突起结构数量太多，难以逐个分析。另一方面，由于相关研究技术，特别是如何在众多滑动突起结构中精确分辨微小能量差异的方法仍然欠缺，常用的DNA融解分析技术相对误差较大，难以针对这种结构进行精细热力学测量。因此其背后稳定性相关的热力学原理尚不明朗。

阅尔团队针对任意长度和序列的滑动突起结构，提出了一种热力学预测模型，并通过实验进行了验证。首先，研究人员解析了序列特异的影响因素，从而系统研究滑动突起结构的扰动模式。通过检测结构简并如何影响这种扰动，从中鉴别出40个常见突起状态用于表征任意滑动突起结构。研究团队开发的Tolehold 交换能量测量技术（TEEM）整合了tolehold交换反应，同时可在一定温度范围内独立检测不同条件下的ΔGG◦，在该研究中被用于精确检测这些状态的自由能。最后，通过与实际试验结果以及文献报道的对比，成功验证了该模型的可靠性。

结果显示，该模型首次成功预测了超过三个重复序列长度的滑动突起结构的自由能状态，针对任意序列或长度的滑动突起结构可以评估其稳定性评分，中位预测误差为0.22 kcal/mol。通过预测可以明确其他文献报道中检测到的微卫星特征。例如，微卫星序列越长或者C/G越高，突变率会越高。

近邻（nearest-neighbor, NN）模型被普遍用于DNA热动力学的近似测算，杂交链的自由能约等于所有基序的ΔG◦与突起的不稳定能量ΔΔG◦之和。通过模型抽象，突起杂交链和与之对应的正常杂交链自由能ΔG◦之差，也就是ΔΔG◦可以用来表示突起扰动能量或者热动力学评分。同时，根据与基序紧邻的两个碱基NNN（next-nearest neighbors）的不同，检测不同温度下四种突起的ΔΔG◦来评估NNN的影响。结果显示，不同NNN对突起ΔΔG◦的影响各不相同。为了保证ΔΔG◦检测的一致性，研究人员选择了两种具有代表性的NNN用于后续研究。

使用代表性NNNs，研究人员进一步探究了滑动突起的结构简并对热动力学的影响。通过分析DNA热动力学的NN模型，为构建滑动突起结构稳定性的预测模型奠定了基础。研究人员基于分割函数以及ΔΔG◦数据建立起了完善的预测模型。

最后，通过对比四种长度滑动突起的ΔΔG◦预测值以及实际检测值检验模型的准确度。此外，利用该模型还可以解释已有文献报道中出现的MSI相关实验结果。例如鸟嘌呤（G）滑动突起的评分最小，对长链微卫星可以起到稳定作用，但同时也提高了C/G的突变率，很多肿瘤MSI相关的研究结果都符合这个规律。

除了从理论上解释MSI的各种特征，该模型还可以辅助MSI相关实验设计，从序列或反应温度等角度指导实验参数设置。例如，在poly(G)区域设计探针引物检测InDel比较困难，更好的选择是互补链上的ploy(C)区域。或者当杂交探针实验涉及到洗脱过程的温度变化时，靶向poly(T)区域会更好，因为温度对其ΔΔG◦的影响更小。对ΔΔG◦的精细预测可以转换为双链结合效率的评估，从而指导更复杂的探针引物设计。

在检测包含InDel或者非特异性序列目标序列时，与探针引物的结合还会产生许多非滑动突起结构。研究团队通过TEEM获取了相关数据，对比以往相关研究，发现该模型可以直接用于DNA杂交性能的预测。此外，如果存在>41 G, >91 C, >101 A 或者 >104 T的重复结构，滑动突起结构可以比一个典型的双链结构更稳定，这提供了一种设计DNA简并稳定结构的思路。

综上所述，阅尔研究团队以单核苷酸微卫星中的滑动突起结构为关注对象，构建了对应ΔΔG◦值的预测模型。此前有研究报道过这种范式的简并结构，但因为忽略了长度对ΔΔG◦的影响，最终并没有据此开发出完善的预测模型。因此，该最新研究基于热动力学的综合分析评估，首次实现了对较长滑动突起结构的自由能状态预测。此外，该模型的构建思想可以进一步扩展，例如研究二核苷酸型甚至三核苷酸型这类与多个神经系统性疾病密切相关的滑动突起结构。

参考文献：

Predicting stability of DNA bulge at mononucleotide microsatellite | Nucleic Acids Research

https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkab616/6325253?searchresult=1

专家点评

“VarTrace MSI qPCR产品特别为基于qPCR的MSI检测而设计，样本来源可以是组织，也可以是cfDNA样本，”阅尔基因美国创新中心的产品副总监Alessandro Pinto表示，“考虑到qPCR的普及性，我们对这项超灵敏技术的广泛应用充满信心。”

VarTrace MSI qPCR的检测灵敏度可以达到1%变异等位基因频率（VAF），相比目前金标准的毛细管电泳检测法优势明显。因此，可以从外周血的血浆中分离出游离DNA作为模板，而不局限于FFPE组织样本。

“简单经济、无创快捷的MSI检测技术能够更好地协助临床医生制定治疗方案，比如帕博丽珠单抗等免疫治疗药物的使用，” 德克萨斯大学MD安德森癌症中心的临床研究副主席、妇科癌症免疫治疗项目主任、阅尔基因科学顾问委员会成员Amir Jazaeri说。“这项研究以及对应产品的发布可能会改善子宫内膜癌患者的临床结局，特别是存在MSI的患者。”

“针对核酸生化性质的底层研究，带来了分子诊断领域的突破性成果，” 该研究的共同通讯作者，阅尔基因美国创新中心负责人、莱斯大学生物工程终身教授David Zhang表示，“阅尔基因在探索和转化核酸相关研究上有着长期投入和技术积累。”

关于阅尔基因

阅尔基因是一家技术创新驱动的全球基因组学公司，拥有多项革命性的分子诊断技术，可将所有NGS平台的测序成本降低50倍以上，并将qPCR、Sanger和纳米孔测序的灵敏度提高100倍以上。阅尔基因在美国休斯顿、中国上海和中国苏州均设有分部。阅尔基因的愿景是创造负担得起的、及时的和准确的基因分析工具，与诸多合作伙伴一起实现精准医疗并改善患者预后。

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