结直肠肿瘤早诊筛查新策略：基于液体活检技术的筛查方案

据GLOBOCAN2020数据统计显示，我国结直肠癌新发病例已经由 2015 年的 38.8 万例增加到2020年的55.5万例，死亡病例由2015年的18.7万例增加到2020年的28.6万例，中国的结直肠癌年龄标准化发病率达23.9/10万，年龄标准化死亡率达12.0/10万。预计到2040年，我国的结直肠癌新发及死亡人数将近乎倍增，新发病例将达到91.2万例，死亡病例将达到54.6万例 ^[1] 。采用简单有效的筛查手段，早期发现结直肠肿瘤癌前病变及早期癌症，尽快遏制结直肠癌发病及死亡增长趋势显得越来越紧迫。然而，我国幅员辽阔，人口众多，地区之间经济发展水平差异巨大，人均医疗资源不足，开展全民筛查不仅经济成本巨大，且难以保证筛查质量。选择性地对适宜人群进行结直肠肿瘤筛查，是当前经济、医疗发展形势下切实可行的策略。

国外普遍将结直肠肿瘤筛查的目标群体限定在50~75岁人群，根据预期寿命及个人健康情况决定对76~85岁人群是否进行筛查，而85岁以上人群不再建议筛查。我国2015年结直肠癌发病及死亡情况分析表明我国结直肠癌发病及死亡负担呈现出男性高于女性，城市高于农村，东部地区高于中西部地区的特点。2015 年年龄别发病率曲线提示25岁以下年龄组发病率均低于1/10万，之后快速升高，50岁以后上升更加明显，在80~84岁年龄组达高峰，男性为212.69/10万，女性为153.83/10万 ^[2] 。2019年我国结直肠癌疾病负担分析提示，15~49岁年龄组发病率男性为16.69/10万，女性为7.32/10万，50~69年龄组发病率男性为102.11/10万，女性为54.80/10万 ^[3] 。参考国外早诊筛查经验，同时结合我国结直肠肿瘤发病分布特点，本方案推荐将50~75岁人群作为一般筛查对象。

推荐筛查对象：50~75岁人群。

（一）问卷风险评估

问卷风险评估利用既往研究中广泛认可的结直肠癌高危因素建立风险评分系统，通过简单的询问问题而获知筛查人群的患癌风险。亚太结直肠癌筛查评分 （Asia-Pacific colorectal screening score，APCS）是经多中心、大样本、前瞻性临床验证所得到的适用于亚太地区人群的结直肠癌初筛方案，其以年龄、性别、家族史和吸烟史4项内容为基础，评分后将筛查人群分为低危、中危以及高危人群，中危和高危人群结直肠癌的检出率分别为低危人群的2.6倍和4.3倍 ^[4] 。APCS评分因其简便、高效、易掌握、易推广等优点获得广泛认可，可作为初筛方案，筛出高危人群直接进行结肠镜检查；而低危、中危和高危接受肠镜依从性差的人群需要其他方法进一步筛查。

推荐初筛方案：对目标人群推荐使用APCS评分初筛，初筛后高危人群直接行结肠镜检查，见表1。APCS评分简单高效，易于掌握和普及，无推荐筛查周期。

（二）血液ctDNA甲基化检测

基于粪便的早筛策略因其操作较为复杂，人群接受度差，实际弃检率高，难以推广和开展。而基于血液ctDNA进行液体活检的策略，不仅含有癌症特异性体细胞突变和表观遗传异常，同时操作方便且无创，可能成为结直肠肿瘤早期诊断的可靠工具。现有的大量研究提示ctDNA甲基化比ctDNA突变位点有更高的灵敏度和动态范围、更多的基因组甲基化靶向区域以及每个靶向区域内同时含多个CpG位点的甲基化改变，因而目前基于液体活检的筛查工作以ctDNA甲基化为主要靶标。

1.血液SEPT9基因甲基化检测

2008年Lofton-Day确定了甲基化SEPT9基因高表达于结直肠癌组织及其外周血，而在健康人群和其余结直肠疾病患者中低表达，由此建立了外周血甲基化SEPT9作为结直肠肿瘤筛查早诊特异性标志物的基础理念 ^[5] 。

2015年第三军医大学的研究显示：对总体结直肠癌患者，甲基化SEPT9灵敏度及特异度分别为74.8%与87.4%，而粪便隐血试验灵敏度及特异度分别为58.0%与82.4%；对结直肠进展期腺瘤患者，甲基化 SEPT9 与粪便隐血试验灵敏度均为26.9% ^[6] 。2017年解放军总医院牵头的多中心研究数据显示：甲基化SEPT9检测结直肠腺瘤总体人群灵敏度为38.7%，锯齿状腺瘤为27.8%，管状腺瘤为28.7%，管状绒毛状腺瘤为53.7%，绒毛状腺瘤为83.3%，非进展期腺瘤为27.5%，无高级别不典型增生的进展期腺瘤为47.0%，伴高级别不典型增生的进展期腺瘤为62.5%，揭示了检测血液甲基化 SEPT9 在筛查结直肠癌前病变的临床价值 ^[7] 。2019年天津市人民医院的研究显示：对结直肠癌患者，甲基化SEPT9灵敏度及特异度分别为73.0%与94.5%，粪便隐血试验为58.7%与91.9%；对结直肠癌前病变患者，甲基化SEPT9灵敏度及特异度分别为17.1%与94.5%，粪便隐血试验为12.2%与91.9% ^[8] 。其余的研究数据显示甲基化SEPT9的诊断数据波动范围较大，其对结直肠癌癌前病变灵敏度11%~39%，对Ⅰ期结直肠癌灵敏度35%~67%，Ⅱ期结直肠癌灵敏度63%~83%，对总体结直肠癌灵敏度48%~77% ^[9-12] 。大多数临床研究提示外周血甲基化SEPT9较粪便隐血试验表现出相似甚至更优的诊断价值。

2.血液多基因甲基化联合检测

单基因甲基化检测存在灵敏度较低的缺点，尤其是对于结直肠癌前病变，因而从肠癌组织、癌前病变组织及正常组织中筛选出多个差异甲基化基因，组合形成多个基因panel联合检测是进一步提高其诊断效能的策略。Cassinotti等 ^[13] 使用6个基因panel （CYCD2、HIC1、PAX5、RASSF1A、RB1和SRBC）区分结直肠癌患者与健康人群灵敏度为84%， 特 异 度 为 68%， 3 个 基 因 panel （HIC1、MDG1和RASSF1A）区分结直肠腺瘤人群与正常人群灵敏度为55%，特异度为65%。

中国国家癌症中心开发了结直肠癌多基因甲基化检测试剂盒，其检测外周血游离DNA上特定基因区域的甲基化水平，并通过机器学习的算法评估受试者患有结直肠癌的风险。该试剂盒检测了126个基因上的149个与肠癌发生相关的差异甲基化区域，并从北京、河北及广东等地10万人群中筛选出含3 493人的肠癌高风险人群用于该试剂盒的前瞻性验证，数据显示对于结直肠癌人群，血液SEPT9基因甲基化检测技术的灵敏度为68%，特异度为79%，AUC值为0.757，而血液多基因甲基化联合检测技术的灵敏度为86.4%，特异度为90.7%，AUC值为0.956。相比于血液SEPT9基因甲基化检测技术，血液多基因甲基化联合检测技术的灵敏度提 高 27.1%，特异度提高14.8%，AUC值提高26.3%。

该检测技术仅需10 mL血即可完成多基因甲基化联合检测，成本为995元/例，较血液SEPT9基因甲基化检测（成本828元/例）成本增加167元，成本增加较小。相较于基于粪便的筛查方法以及结肠镜检查，检测外周血 ctDNA 甲基化不仅无创，而且操作更方便。有研究统计调查了人群对结肠镜检查、血液检查及粪便检查选择倾向，63%的患者拒绝结肠镜检查，这部分群体中83%选择血液筛查，15%选择了粪便筛查，提示血液游离DNA甲基化筛查更容易被人群所接受，依从性更高，参与率更高 ^[14] 。

推荐精筛方案：对于问卷调查评分后需精筛的人群选择血液多基因甲基化联合检测技术，其具有无创、操作简便的优势，容易被人群接受，可提高早诊筛查效率。推荐筛查周期为1年1次。

国家癌症中心团队开发的血液多基因甲基化联合检测试剂盒基于酶转化文库构建方法检测人群外周血游离DNA中相关基因区域的甲基化差异，该方法利用两个酶促步骤来区分胞嘧啶及其修饰形式5mC/5hmC（技术发明专利：ZL202210188194.7）。而酶转化的DNA不像重亚硫酸氢盐转化的DNA那样碎片化，对cfDNA的损伤更小，因此相比较常规重亚硫酸氢盐转化可以更加稳定地检测到CpG的甲基化状态的变化情况。其整体检测步骤包括外周血游离 DNA 的提取和片段筛选，预文库构建（包括末端修复和加接头步骤以及两步酶法转化），预文库构建后采用探针捕获的方式对目标基因区域进行富集，而后进行高通量测序进一步分析检测结果。整个流程从血液获取开始，实验操作周期包括：3个工作日完成富集后的终文库构建，3~5个工作日完成高通量测序步骤，2~3个工作日完成分析流程，总流程为8~11个工作日。

由于我国人口基数大，人均医疗卫生资源缺乏，为保证合理利用现有的医疗资源，筛查工作需采用多步骤策略以尽可能浓缩高危人群，尽可能提高结肠镜下肿瘤检出率，并避免不必要的肠镜检查，以达到最小的成本和最大的获益。通过APCS问卷评分以及外周血多基因甲基化联合检测，问卷评分为高危或外周血检测阳性者为高危人群，需进一步行结肠镜检查。而对于问卷评分非高危，并且外周血多基因甲基化联合检测阴性人群，则按推荐的周期进行多轮筛查。推荐筛查流程：见图1。

图1　结直肠癌推荐筛查流程