CAR-T 细胞治疗药物开发工作的产品表征

迄今为止，最引人注目和最一致的临床结果是在复发/难治性B细胞衍生的血液系统恶性肿瘤患者中使用CD19导向的CAR-T细胞疗法获得的；成人和儿童急性淋巴细胞白血病 (ALL) 显示出最持久的完全缓解 (CR) 率。尽管CD19 CAR-T细胞疗法取得了非凡的成功，但药物产品的特定活性成分仍不清楚。

有多种因素可能会影响CAR-T药物产品的活性，包括：最佳载体和转导方法、培养条件、CAR 设计、T 细胞类型和细胞类型的剂量。此外，还有一组复杂的肿瘤、宿主和环境因素控制着由注入的CAR-T细胞治疗产品介导的抗癌反应的强度和时间[4]。

在某些情况下，CAR-T细胞疗法也有可能引发危及生命的严重不良事件，包括细胞因子释放综合征、肿瘤溶解综合征、B细胞发育不全和神经毒性（表 2）。CAR-T细胞疗法的潜在毒性在Juno Therapeutics 赞助的JCAR015项目中得到了最显着的揭示，该项目用于治疗复发或难治性成人B细胞ALL患者。

2016年7月，三名患者在输注Juno Therapeutics的CD19 CAR-T细胞疗法后出现致命的脑水肿，这是一种基于逆转录病毒的混合T细胞产品 [5]。Juno Therapeutics推测死亡原因是环磷酰胺和氟达拉滨联合预处理方案[5]。经过短暂的临床试验后，Juno Therapeutics 恢复了ROCKET试验，完全从预处理方案中消除了氟达拉滨。尽管采用了这种强度较低的方案，但在2016年11月的ROCKET试验中，又有两名患者出现了致命的脑水肿。在第二组患者死亡后，朱诺得出的结论是，悲惨的结果反映了“患者特定的因素、接受的预处理化疗患者以及与产品相关”[6]。从本质上讲，药物产品特异性和患者特异性因素都会导致意想不到的毒性。

CD19 CAR-T细胞疗法的临床经验，在疗效（表 1）和安全性（表 2）方面，突出了组织需要创建超越药物开发工作传统界限的统一分析表征策略。这篇简短的文章将重点介绍 CAR-T 细胞治疗药物产品开发的一些主要挑战和机遇。

CAR-T细胞疗法制造需要几个精心执行的步骤，包括：淋巴细胞收集和富集、淋巴细胞激活、CAR构建体的基因改造、淋巴细胞扩增、收获和最终配方（图 1）。

1、CQA和效价

在此制造框架内，识别和监控与制造和临床成功相关的关键质量属性 (CQA) 成为CAR-T细胞疗法制造的整体分析表征策略的主要目标，对其进行定义、测量和持续监控，以确保最终产品输出保持在可接受的质量范围内。

相对于传统生物药，活细胞产品的复杂性要高得多，对其作用机制的理解不完全，产品表征的困难和起始材料的可变性。例如，就起始材料而言，大多数 CAR-T 细胞疗法制造协议使用通过单采收集的自体外周血单核细胞 (PBMC) 浓缩物。然而，除淋巴细胞外，单采产品通常还被不同数量的红细胞、单核细胞、中性粒细胞、血小板、原始细胞和骨髓来源的抑制细胞污染。这些污染细胞的频率会对CAR-T细胞制造过程的整体成功产生重大影响[7]。因此，一个严格的分析计划可以识别和监控传入的单采起始材料的CQAs成为CAR-T细胞疗法制造策略整体成功的核心。

在MAb制造的背景下，生物制造过程，细胞表达系统的CQA与治疗产品的CQA之间的相互依赖性必须并且可以相互分离[8,9]。然而，这对于CAR-T等细胞疗法是不可能的，因为细胞本身就是将要给药的产品。因此，最终产品 CQA 和治疗细胞所经历的生物过程环境是相互依赖的，需要同时进行优化、控制和监测。这适用于细胞培养操作和从原材料进入到最终产品配方的整个制造过程。CAR-T细胞治疗药物产品的最不了解的最终产品CQA 之一是效力。

效力测量是产品表征测试、可比性研究和稳定性方案所必需的整体分析表征策略的一个组成部分，用于确定在临床研究的所有阶段都使用一致生产的产品。理想情况下，效价测定将代表药物产品的作用机制。在CD19导向的CAR-T疗法的背景下，最常用的效力测定是通过铬释放测量的细胞毒性和通过 ELISA测量的干扰素γ（IFN-γ）释放。在这两种情况下，最终的患者特异性 CAR-T 细胞治疗药物产品都与稳定表达CAR-T特异性肿瘤抗原的细胞系（例如K562细胞）共培养。尽管它们广泛用作效力的释放试验，但IFN-γ和细胞毒性试验都不能预测整体临床疗效和安全性[11,12]。这应该不足为奇，因为这两种分析都没有考虑到 T 细胞表型和功能的全部多样性。

使用质谱流式细胞术对外周血衍生的T细胞进行的体外表征表明，有多达数十万种独特的T细胞表型具有无数的功能[13]。尽管迄今为止尚未对CAR-T细胞治疗药物产品进行全面表征，但据推测，注入的CAR-T细胞产品具有比IFN-γ和细胞毒性更多的功能特性。

此外，由于IFN-γ和细胞毒性试验使用人为的非患者特异性细胞系作为替代肿瘤靶点，这些试验忽略了患者特异性肿瘤异质性和注入CAR-T细胞的肿瘤微环境 (TME)。例如，就TME而言，最近的几份报告表明，抗肿瘤T细胞的效力受到巨噬细胞和其他骨髓细胞类型的共同浸润的严重调节，并且这些相互作用在患者存活中发挥着重要作用[14, 15]。这些结果强调了在研究CAR-T细胞治疗药物产品效力和整体临床反应因素时个性化免疫反应谱的重要性。

展望未来，有必要设计考虑到CAR-T细胞治疗药物产品中临床相关功能的全方位的效价分析，并且理想情况下，如果可能的话，设计这些分析以更能反映患者特定的肿瘤和TME。事实上，FDA建议一种检测方法可能不足以衡量细胞治疗产品的效力，例如CAR-T细胞疗法，这些产品显示出复杂的作用机制。在这种情况下，FDA建议开发多种互补检测，以测量与质量、一致性和稳定性相关的不同产品特性[10]。当一起使用并且结果与相关生物活性相关时，这些互补检测应提供足够的效力测量。

2、剂量与疗效的关系不明确

对于CAR-T细胞疗法，剂量和制造成功的概念尚不明确。产生更多 CAR-T细胞的制造工艺不一定比产生较少CAR-T细胞总数的工艺更好。

例如，在宾夕法尼亚大学对CLL患者进行的CD19 CAR-T细胞治疗试验中，使用慢病毒转导的T细胞表达与 41BB 共刺激结构域相关的 CAR 构建体，研究人员报告了最佳的抗肿T细胞剂量的反应比该队列中报告的其他两名患者的T细胞剂量低40至80倍 [18,19]。

同样，在纪念斯隆凯特琳癌症中心 (MSKCC) 进行的研究中，使用逆转录病毒转导的 T 细胞表达与CD28共刺激结构域相关的CAR构建体，研究人员指出，相比之下，较低剂量队列中的客观反应更好以三倍高的CAR-T细胞治疗药物产品剂量治疗的患者[20]。

总的来说，这些发现表明，超出制造的CAR-T细胞绝对数量的临床因素，例如患者的肿瘤负荷，可能在设定剂量限制以及制造成功的概念方面发挥重要作用[17]。这些细胞通常通过静脉输注，吸收显然不是问题。分布、代谢和排泄也需要彻底重新考虑 [21]。

Chapuis等人最近的一项研究很好地说明了“活”T细胞免疫疗法药物产品（如CAR-T疗法）的剂量和药代动力学的复杂性[22]。在这项研究中，作者应用高通量TCR Vß测序来鉴定多克隆肿瘤特异性细胞毒性T细胞 (CTL) 药物产品中的单个T细胞克隆型。使用这种方法，他们能够在输注到患者体内后追踪个体克隆型，然后推断最终导致肿瘤消退的细胞的过继转移（内源性）频率。作者发现，在获得持久完全反应的患者中，转移的CTL的组成主要由源自单个T细胞克隆型的细胞构成，并且这种克隆型在内源性样品中的含量通常低于 0.001%。这些结果表明抗肿瘤反应是由表现出增殖或存活优势的稀有 T 细胞群介导的。

目前CAR-T细胞疗法缺乏对正在测试的药物产品、CQAs以及支持CAR-T细胞疗法的患者特异性生物标志物的全面机械知识药物产品在体内完全发挥功能。

除了这种复杂性之外，CAR-T细胞疗法模糊了传统药物开发的许多界限。例如，患者来源的起始材料（即单采）传统上被视为临床样本，因此属于转化医学或制药/生物制药组织内的相关科学小组的职权范围。然而，在细胞疗法的背景下，透彻了解单采对于确保可重复制造至关重要，因此制药/生物制药公司内的CMC团队对这些样品具有同等的权利，用于发现目的，旨在确定与制造成功相关的CQA。“制造成功”的确定与转化医学/相关科学小组的产品一样多它是给CMC的。

面对这种复杂性，可能的解决方案是实施系统生物学方法来识别与制造和临床成功相关的CQA和生物标志物。这个过程需要在整个药物开发过程中协调临床生物标志物和制造CQA工作，从临床前发现分析到制造和质量控制放行分析，再到相关研究和临床读数。从有限数量的临床材料中捕获大量定量信息的高通量分析的应用变得至关重要，尤其是在早期临床试验中。捕获不同信息集的多参数平台和分析包括用于询问免疫细胞表型和功能的基于细胞的平台、核酸、可溶性或蛋白质组学分析系统，允许对来自单个小样本的大量分析物进行同步和定量分析；高通量TCR测序策略以了解抗肿瘤CAR-T细胞反应的广度和基于高通量血清的蛋白质组学策略以评估抗肿瘤反应。

这种类型的方法已经为CAR-T细胞疗法产生了几个切实的成功案例。

例如，一项在CAR-细胞上使用基于高通量和不可知血清的蛋白质组学平台的研究表明，治疗后可能存在表位扩散，表明存在全身性肿瘤特异性适应性免疫反应[23]。

在另一项研究中，作者能够使用各种生物信息学工具和预测算法来识别新的T细胞表位，从而能够识别对这些表位具有反应性的T细胞，以进一步测试其体外靶细胞杀伤功能[24]。最后，使用不可知的细胞因子分析能够将IL-6鉴定为接受 CAR-T 细胞疗法治疗的患者子集中的严重细胞因子释放综合征 (CRS) 的标志物；这一观察结果随后导致使用托珠单抗治疗作为这种潜在致命综合征的有效缓解策略[25]。

上述案例支持一个模型，其中在早期临床试验中使用广泛的、不可知的和质量控制的分析平台来全面描述可能与 CQA 相关的患者特异性临床生物标志物和药物产品特异性属性（图 2）。

整合这两个数据集（即患者特定的生物标志物和药品特定的属性）将能够生成与 CAR-T 疗法的功能和机制方面相关的综合假设，然后可以在更先进的关键阶段临床中进行前瞻性测试 试验（图 2）。这种方法有可能增加我们对与整体安全性和有效性相关的患者和药物产品特定属性的理解，并将成为旨在扩大 CAR-T 细胞疗法的下一代制造和临床试验策略的重要驱动力。