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2021年9月12日/医麦客新闻 eMedClub News/--9月2日晚，医麦客携手丹纳赫生命科学为大家带来一场主题为“mRNA药物研发与生产在线研讨会”的线上直播课程。
在抗击这场新冠疫情中，mRNA技术异军突起，mRNA疫苗快速研发，快速临床，快速获批，为全球健康的恢复做出了巨大作用，mRNA技术也因此吸引了社会各界的广泛关注。
在研究界中，mRNA技术也逐渐开始拓展其适应症范围，例如肿瘤免疫治疗、治疗性蛋白替代疗法和遗传疾病治疗等，同时制药巨头们也纷纷加快mRNA在这些领域的研究。
面对持续升温的mRNA市场，mRNA技术在药物研发上也提出了更高的要求，为助力中国医药产业人才成长，本期医麦课堂携手丹纳赫生命科学，邀请到启辰生生物科技（北京/珠海）有限公司的联合创始人兼CTO 栗世铀博士；丹纳赫生命科学的应用科学家 徐玲丽；恺佧生物科学应用总监 谢宏林；颇尔生物技术部首席科学家 王君博士为观众分享在mRNA药物研发和生产的经验分享。
公开课精彩回顾
在生产制备mRNA疫苗的过程中，有三个主要的关键质量属性，分别是质粒阶段、RNA的结构和递送载体方面，这三个方面是mRNA区别于其他生物制药的一些比较特殊的关键质量属性，也意味着我们需要使用不同的技术或方法去对这三个方向进行分析表征。
质粒的拓扑结构分析：从大肠杆菌中提取的质粒天然有三种主要的拓扑结构，分别是超螺旋的、开口的和线性的，这三种结构的功能有所不同，大部分情况下我们需要的是转染效率最高的超螺旋，所以需要使用比较合适的方法对它进行检测。
FDA用于基因制剂质粒DNA的指导意见要求，超螺旋质粒百分比需要大于80%；我国《生物技术药物研究开发和质量控制》一书中指出，对于质粒类生物制品超螺旋比例一般要大于90%。
毛细管电泳就是一种可以很好对质粒的拓扑结构进行分离检测的方法。PA 800 Plus毛细管电泳制药分析系统可以对质粒甚至mRNA的结构进行检测，它采用专利的循环冷却控温系统，可以实现毛细管温度的精确控制，保证结果的重复性和稳定性。
mRNA药物的结构分析：mRNA在内环境当中是不稳定的，容易降解，因此在制成mRNA药物时，我们需要对它进行加帽加尾，使它能够稳定的保持在环境当中，并且保持一定的翻译效率。所以在后面的相关部分，需要对它的加帽加尾进行检测。
目前通常使用毛细管电泳和质谱的方法进行分析，在加帽加尾的检测方面，就稍微有些复杂，不仅需要对样品进行检测，还需要提供一个成熟的前处理方案，毛细管电泳和质谱各有所长。
质谱可以精准的进行定量，对加帽的不同类型进行检测，在对mRNA表征方面，比较适合做前端进行高准确率的验证；而在后期要进行大量样本或大型检测，毛细管是比较好的方法。这两种方法能够很好的相互配合，来满足生产或前期开发当中对mRNA表征及质控的需求。
mRNA药物的递送系统质量分析：现在一般是使用LNP进行mRNA递送，mRNA的包装不同于AAV基因治疗，mRNA的包装是需要实时的将核酸以及脂质体成分混合，然后通过微流控芯片使得脂质体包裹mRNA。所以这方面的质控和表征非常重要，需要对包封率和包封后的大概粒子形态等进行检测。
《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则》（试行）当中，也罗列了一些相关检测要点。包括脂质体形态学观察和纳米药物装载量检测，但现在脂质体检测方面还需要进一步的优化和补充检测方法。
对于以上提到的几点检测，丹纳赫作为全球医药行业的领军赋能企业，结合了旗下贝克曼、美谷分子、SCIEX、Phenomenex、Leica、颇尔、Cytiva（思拓凡）和IDT八家公司的技术，能够为客户提供mRNA质控表征的全方位整体解决方案。
mRNA药物/疫苗是当前最具代表性的新技术之一，在包括肿瘤治疗、传染病治疗等多个应用场景皆有非常好的潜力，其未来的拓展潜力也非常值得看好，例如蛋白替代、抗体替代以及基因治疗等。
在mRNA生产过程中对酶的需求是较高的，在质粒的信息化、mRNA synthesis（mRNA合成）、Capping（加帽）和Tailing（加尾）过程中都需要各类酶的参与。
体外转录（IVT）技术：RNA的IVT生产核心三要素为：T7 RNA聚合酶、模板和底物，以及其他关键因素。谢宏林老师具体分析了这些因素对mRNA产率的影响，并对双链RNA的产生进行分析以及提供了一定的解决方案。
mRNA加帽技术：帽子结构对mRNA的表达至关重要，目前的加帽技术有两种，一种是共转录法，一种就是牛痘加帽酶法。谢宏林老师具体分析了这两种加帽方法的优缺点。
随着mRNA产业的发展，谢宏林老师表示，国家对于mRNA相关的原材料法规要求会越来越严格，尤其是对酶的质量要求。
关于mRNA的GMP生产，现在业界已经看到了Moderna和BioNTech在GMP要求下大规模生产了新冠疫苗，但是他们的生产工艺并没有完全公开。
GMP级的mRNA体外合成步骤基本上包括质粒线性化、体外转录、加帽加尾等环节。这些步骤都可以在常温常压下采用一次性混合器或者一次性反应器来完成这些反应。
接下来，mRNA生产也有两条不同的工艺路线，路线一采用超滤浓缩/换液+DNA降解。路线二采用阴离子捕获层析+疏水或亲和层析+精制层析。路线一没有层析步骤，但对于转化率、降解率的参数要求是一个较高的挑战。
经过这些过程拿到纯化的mRNA以后，下一步的超滤浓缩/换液、LNP制备、LNP浓缩换液，以及最后的LNP除菌过滤，这些步骤都是相通的。不过，由于LNP结构复杂，超滤浓缩、除菌过滤都有响应的难点。王君老师在本期医麦课堂中重点介绍了这些工艺的方法，并分享了应用案例和关键数据。
采用传统方法洗滤换液，速度缓慢，平均粒径变化严重，出现杂峰。单程切向流技术，即SPTFF（Single-Pass Tangential Flow Filtration）用单向的长流路替代了传统的循环流路，显著降低了剪切力，提高了产品收率。对于剪切力敏感的LNP来说，有非常好的保护效果；同时能够实现浓缩换液，在LNP中有着非常好的应用。
问答环节
1
根据刚才课程中所提到的，采用毛细管方法时，为什么PolyA尾的峰有很多很尖锐的峰？
2
在层析的过程中，哪一种方式可以去除不是超螺旋的质粒，比如线性的或者缺口的质粒，该选择什么样的层析方式？
王君老师：根据我们的一些实验结果，可以用MustangQ把开环的去除掉，不过这与质粒的结构、开环的载量也有关系。
3
开环和超螺旋质粒的分子量和线性化的有显著性的差别吗？
4
Single-PASS TFF在三轮稀释浓缩之后的粒径变大，那么是由于LNP结构被破坏了吗？
5
在超离方法用于LNP包封的过程中，离心力会不会破坏LNP的结构？
6
LNP在生产过程中，它可能会用到一些有机溶剂，比如说乙醇。一次性的混合器用到的袋子和管路，是否能耐受95%的乙醇？无菌过滤用的膜是否也能耐受？
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