吸入式且可常温长时间保存的新款疫苗，已进入临床前测试

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新冠肺炎（COVID-19）的全球大流行，就像拍了又拍的连续剧，总是续集不断。目前在全球范围内，至少有36款新冠疫苗在一个及以上的国家获得批准。这些疫苗大多通过肌肉注射接种，接种后产生在血液中循环的抗体。且在新冠疫苗的运输与储存方面，一些疫苗需要低温冷冻状态下才能运输和储存。

为了更方便、快捷、有效地产生效果，科学家们一直在努力，希望能开发出可以有效刺激黏膜免疫，还能无创或无针接种，并且能在常温下长期稳定，就能弥补当前新冠疫苗的不足，也能提高疫苗接种率。

7月4日，北卡罗莱纳州立大学程柯团队在Nature子刊Nature Biomedical Engineering发表了题为“Exosomes decorated with a recombinant SARS-CoV-2 receptor-binding domain as an inhalable COVID-19 vaccine”的研究论文[1]。论述了该团队设计了一种基于外泌体（exosome）的、可吸入的新冠疫苗，并进行了临床前测试，该新冠疫苗可在冻干后在室温下稳定超过3个月。这无疑为今后的疫苗接种提供了更多选择。

脂质体纳米颗粒（NP）已被广泛用于RNA疫苗的传递。例如，mRNA-1273（Moderna公司）、BNT162b1（BioNTech和辉瑞）和ARCoV mRNA疫苗（Walvax生物技术公司、苏州艾博基因生物科学有限公司和军事医学科学院）都是脂质纳米颗粒配制的RNA疫苗。该研究设计的新冠疫苗由与肺源性外泌体结合的重组新冠病毒受体结合域（RBD）组成，能够增强RBD在呼吸道和肺部的保留。

SARS-CoV-2属于冠状病毒病毒家族，它们是包膜的正链RNA病毒，具有棘突蛋白复合物，可识别宿主细胞受体并与之结合。具体而言，SARS-CoV和SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基中的受体结合结构域（RBD）与宿主气道上皮血管紧张素转换酶2（ACE2）受体结合，然后通过S2亚基融合病毒和宿主膜，使RBD成为中和抗体和疫苗的特定靶标。以往的研究已经证明了SARS-CoV RBD作为强效中和抗体靶标的功效。SARS-CoV-2的体外研究表明，宿主抗体与RBD相互作用，与其结合并发挥中和作用。它还阻断了SARS-CoV-2和SARS-CoV进入表达ACE2的宿主细胞，这表明其作为病毒附着抑制剂的潜力。但仅管理RBD并不能实现特定的目标交付，也不能逃避降解或快速清除。RBD必须通过药物递送载体进行保护，该载体优化抗原呈递细胞（APC）的剂量。

病毒样颗粒（VLP）和纳米颗粒（NPs）是强大的药物递送载体，外泌体是一种在体内发现的天然存在的细胞外囊泡，这使其成为靶向药物递送的天然和理想的递送囊泡，在靶向相同的组织受体细胞方面表现出色。它们含有由具有治疗特性的蛋白质，脂质和核酸组成的分子成分混合物。此外，外泌体可以通过创建表面修饰来表达蛋白质或肽来增强靶向性。

研究团队从人类肺供体样本中衍生出肺球体细胞（LSC），其再生能力已经在啮齿动物模型中得到证明。该团队在之前已经研究了IPF啮齿动物模型中通过雾化处理LSC衍生外泌体（LSC-Exo）的安全性和生物分布，论文于2020年2月发表于《Nature Communications》[2]。LSC-Exo是用于肺部治疗的天然脂质体纳米颗粒（NP），来源于肺细胞的异质性群体，包括I型和II型肺细胞以及间充质细胞。同时，该团队通过利用LSC-Exo和RBD的特性，将RBD偶联到LSC-Exo（RBD-Exo）的表面上来设计可吸入的疫苗，从而创建了一种模拟病毒形态的病毒样颗粒（VLP），以此证实了啮齿动物肺支气管和实质的有效外泌体输送。与肌内注射COVID-19疫苗相比，吸入RBD-Exo诱导产生针对SARS-CoV-2的中和抗体，并触发黏膜免疫系统在肺部产生抗原特异性分泌IgA（SIgA）和T细胞反应，以抑制肺部上皮的病毒摄取（图1）。

图1 吸入RBD-Exo VLP疫苗在小鼠中诱导SARS-CoV-2中和并保护其肺部

该研究评估了RBD-Exo VLP疫苗在高剂量SARS-CoV-2感染小鼠中的保护作用，这些小鼠临床感染严重，且伴随着快速的体重减轻和严重的肺部病变。在接种两剂RBD-Exo疫苗后，小鼠肺部SARS-N蛋白水平和抗病毒蛋白1型干扰素反应基因MX1的表达均显著降低，且没有增加小鼠血清中IgE和RBD特异性IgE抗体的产生。表明两剂RBD-Exo吸入强烈诱导全身T细胞免疫反应，疫苗诱导的高效抗体将减少病毒复制，从而可以有效地保护小鼠免受SARS-CoV-2感染且没有过敏型反应。

与肌内注射疫苗相比，吸入疫苗提供了两层额外的保护：疫苗引发的IgA和呼吸道黏膜中的常驻T细胞，为病毒通常进入和繁殖的部位提供有效的屏障；交叉反应性常驻T细胞，阻止病毒复制并减少病毒脱落和传播。更重要的是，与肌内注射相比，通过吸入途径进行黏膜疫苗接种有可能在呼吸道中赋予免疫力，阻止病毒传播。RBD-Exo雾化的另一个优点是非侵入性，这可能会鼓励那些害怕针头的人接种疫苗，从另一方面提高接种率。

RBD-Exo冻干酸盐在−80°C，4°C和室温（21°C）下储存21 d（3周）或3个月。将RBD-Exo冻干产物分散在PBS中，并使用NTA检测其大小和浓度。此外，使用ELISA试剂盒对Exo上RBD的浓度进行定量。根据ICH指南，在（40±2）°C和75%±5%相对湿度下对RBD-Exo冻干剂进行了加速稳定性测试，结果表明，在3周，3个月，6个月样品稳定性良好。

该研究也存在一些局限性。比如，外泌体的大规模生产和纯化具有挑战性，需要有一定基础的生产经验。外泌体的货物和表面配体可能会因批次不同有一定差异。由于NHS酯在水性条件下的不稳定性，DSPE-PEG-NHS与RBD的附着将与酯在反应缓冲液中的水解竞争。同时，吸入性疫苗通常不推荐用于有呼吸系统并发症的患者使用。

综上所述，该研究开发的这种吸入式、室温稳定的病毒样颗粒（外泌体）疫苗，可作为有前景的新冠候选疫苗，值得未来的研究和开发，为将来的开发和研究提供了新思路和新选择。

参考文献：

[1]https://www.nature.com/articles/s41551-022-00902-5

[2]https://www.nature.com/articles/s41467-020-14344-7