Nat Biotechnol | 无需外源蛋白——在体RNA精准编辑的新策略CLUSTER

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2022年1月3日，来自德国图宾根大学的Thorsten Stafforst实验室在Nature Biotechnology杂志上发表了题为CLUSTER guide RNAs enable precise and efficient RNA editing with endogenous ADAR enzymes in vivo的论文。文章对gRNAs的设计原则进行了归纳总结，并通过gRNAs的优化改造，开发出无需外源蛋白的新策略CLUSTER，实现了细胞和动物体内RNA的高效精准编辑。

早在2017年研究者便指出，gRNA中添加可富集内源性RNA腺嘌呤脱氨酶ADAR的特异性序列（R/G-结合域），可增强RNA精准编辑效果（A>I编辑）。在此基础上，研究者又增加多组单链募集序列（RS序列），开发出了CLUSTER RNA编辑策略（图1）。与已有的LEAPER策略相比，CLUSTER策略中的RS序列可结合目标mRNA中相距甚远的不同区域，并能与R/G-结合域协同提升gRNA的结合强度和特异性，与此同时还能保证gRNA设计的灵活度。研究者还开发出计算机程序优化RS序列和gRNA的设计，以进一步提升CLUSTER策略对RNA的精准编辑效果。

图1 CLUSTER策略的设计原则：gRNA的5’端为可富集内源性RNA腺嘌呤脱氨酶ADAR的R/G-结合域，中间为gRNA的靶位点结合序列，3’端为RS序列。

研究者开发出一种携提前终止密码子（5’-UAG）的双荧光素酶报告系统，以更好的检测CLUSTER策略的效果。结果显示，CLUSTER策略中的RS序列和R/G-结合域均能有效提升gRNA的精准编辑效率，而单纯增加gRNA中靶位点结合序列的长度对编辑效果影响甚微。研究还发现，人类组织中广泛高表达的内源性RNA腺嘌呤脱氨酶ADAR1的p110可变剪接体是关键酶。此外，与质粒转染相比，腺病毒为代表的病毒递送体系能进一步提升CLUSTER策略的RNA精准编辑效果并在多种细胞系中表现良好。不过，除报告系统、内源性ADAR蛋白和gRNA的表达水平外，仍有多种未知因素会影响CLUSTER系统的RNA精准编辑效率，因此该领域仍有很多问题有待深入分析。

随后，研究者对CLUSTER策略中影响RNA精准编辑效果的多种因素进行了系统性的分析，以更好的归纳总结gRNA设计原则。研究指出，至少2组RS序列才能保证RNA编辑的有效性，但超过3组RS序列后，进一步增加数量并不利于改善RNA编辑效率。不过，改变RS序列的长度对CLUSTER策略的RNA编辑效率有明显影响：3组15 nt长度的RS序列较7 nt长度的RS序列有更好的编辑效率（提升幅度达33倍）。此外，不同组RS序列在目标mRNA上的分布同样重要，RS序列间较近距离（15-62 nt）的效果要明显优于远距离（375-460 nt），不过当RS序列间距为1500 nt时，CLUSTER策略仍有很好的RNA编辑效果。研究还指出，增加gRNA中3’端RS的序列长度（15 nt增加至20 nt）可进一步提升RNA精准编辑效率。

随后研究者对CLUSTER策略在疾病治疗中的潜力进行了分析。首先针对外源表达的8种含终止密码子突变的mRNA转录本，研究者设计出特异性的gRNA并在HeLa细胞中检测其RNA编辑效率，结果显示其修复效率为3%~61%，且并无明显的邻近碱基脱靶。针对内源性突变转录本的RNA编辑研究也发现，CLUSTER对RNA的A>I编辑效率高（19%~44%），且无明显的邻近碱基脱靶。研究者还在赫勒氏综合症患者来源的成纤维细胞中证实了CLUSTER策略在RNA水平修复致病点突变的有效性。以上结果均表明，CLUSTER策略的应用前景值得关注。

已有的LEAPER策略同样不依赖外源蛋白，但其gRNA设计策略与CLUSTER不同。为此，研究者对两种策略的效果进行了多重比较。报告系统中的比较显示，携3组15 nt短RS序列的CLUSTER gRNA与LEAPER的编辑效率相近，而1组20 nt+2组15 nt RS序列的CLUSTER gRNA效率提升了1.4倍。含致病点突变的mRNA转录本修复研究中，CLUSTER与LEAPER策略在编辑效率上各有特点，但邻近碱基的脱靶效率上CLUSTER有明显优势。

最后，研究者还在小鼠模型中利用双荧光素酶报告系统验证了CLUSTER策略的体内编辑效果。结果显示，小鼠体内，CLUSTER策略依然能发挥很好的RNA编辑效果，通过优化gRNA设计，其RNA编辑效率可达10%。

总体而言，本研究提供了一种全新升级版的RNA精准编辑新策略CLUSTER，该策略无需外源蛋白便可实现RNA目标位点的A>I精准编辑。研究者还将CLUSTER策略与已有的LEAPER策略（同样无需外源蛋白）进行综合评比，指出两种策略在RNA精准编辑效率上不相上下，但CLUSTER策略在邻近位点的脱靶效率上有明显的优势，因此未来的应用前景更加广阔。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41587-021-01105-0

1. Smargon, A.A., Shi, Y.J. & Yeo, G.W. RNA-targeting CRISPR systems from metagenomic discovery to transcriptomic engineering. Nat Cell Biol 22, 143–150 (2020).

2. Abudayyeh, O. O. et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature 550, 280-284, doi:10.1038/nature24049 (2017).

3.  Cox, D. B. T. et al. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science 358, 1019-1027, doi:10.1126/science.aaq0180 (2017).

4.  Konermann, S. et al. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors. Cell 173, 665-676.e614, doi:10.1016/j.cell.2018.02.033 (2018).

5.  Yan, W. X. et al. Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein. Molecular cell 70, 327-339.e325, doi:10.1016/j.molcel.2018.02.028 (2018).

6.  Abudayyeh, O. O. et al. A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing. Science 365, 382-386, doi:10.1126/science.aax7063 (2019).

7. Qu, L. et al. Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs. Nat. Biotechnol. 37, 1059–1069 (2019).