​Nat Commun | 张传茂实验室揭示微管结合蛋白NuMA通过相分离调控纺锤体长度和动态性的分子机制

责编 | 酶美

纺锤体是真核生物细胞中重要的临时细胞器，调控了姐妹染色单体的分离和细胞分裂的方向。纺锤体是高度动态的，微管时刻处于增长和缩短的变化当中。当纺锤体的动态性被破坏，通常导致遗传物质的不稳定，基因组的不稳定性与肿瘤发生密切相关 【1-3】 。许多微管结合蛋白都参与了纺锤体动态性的调控，其中微管解聚蛋白Kinesin-13家族的成员发挥了重要的作用。Kif2A是Kinesin-13家族具有代表性的成员，通过解聚纺锤体极上的微管调控了纺锤体微管的极向流动以及染色体的列队和分离 【4-7】 。微管的极向流动是调节纺锤体长度的开关。当微管间的滑行与微管动态性达到平衡时，纺锤体保持相对稳定的长度，因此可以观察到向纺锤体极移动的“微管光斑” （tubulin speckle） ，即微管的流动 （microtubule flux） 【8, 9】 。抑制纺锤体极处的微管解聚，将会抑制这种极向流动，进而造成纺锤体延长 【10】 。纺锤体的高度动态变化使得纺锤体的装配与调控过程成为细胞周期研究中的难点，这个过程的分子机制仍有许多是未知。

近年来，由相分离形成的无膜细胞器的研究为纺锤体的调控提出了一个新的方向。这些被单独分割的无膜区域可以进行不同的生化反应或执行不同的功能，如应激颗粒，转录共激活因子，核仁等。由相分离形成的生物凝集体，也可能会经历由液态转变为胶体或固体的“相变”过程。生物凝集体拥有独特的理化性质，在基因复制，转录，信号转导等方面发挥重要功能【11】。随着有丝分裂期纺锤体装配和细胞分裂的研究逐渐深入，研究者们开始用相分离的概念进一步揭示这个高度动态过程的分子机制。如纺锤体基质蛋白BugZ通过相分离调控微管的成核，成束和纺锤体的装配 【12】 ，纺锤体装配因子TACC3通过相分离诱导液体样减数分裂纺锤体的形成 【13】 。这些研究有助于我们进一步认识纺锤体装配过程中复杂的生化反应的调控机制。

2021年12月9日，北京大学生命科学学院张传茂团队在Nature Communications杂志上发表了题为 NuMA regulates mitotic spindle assembly, structural dynamics and function via phase separation 的工作。该项工作发现纺锤体装配因子NuMA在有丝分裂期通过液－液相分离凝集到纺锤体极上，并将微管解聚蛋白Kif2A隔离到纺锤体极的区域进行有效的微管解聚，从而调控纺锤体的长度和动态性，这一过程受到了有丝分裂期激酶Aurora A的磷酸化调控。

NuMA作为重要的微管结合蛋白，在纺锤体的装配和微管组织中发挥了重要的功能。但NuMA分子量较大及结构的低复杂性，其功能及作用机理仍需进一步探究。在本项工作中，该团队发现纺锤体装配蛋白NuMA调控了纺锤体的长度和动态性。NuMA蛋白的缺失导致了纺锤体长度明显增加，并且能够减弱抑制Aurora A激酶造成的纺锤体变短的现象。光激活实验发现NuMA的缺失导致微管流动速率减慢，这可能是造成纺锤体长度增加的原因。而过表达NuMA导致纺锤体长度减小，进一步提示NuMA调控了纺锤体动态性。

为了进一步探究NuMA如何调控纺锤体长度和动态性，通过活细胞动态实验，观察了NuMA在整个细胞周期中的动态变化，发现NuMA在有丝分裂期经历液－液相分离的过程。间期NuMA在核内与DNA结合，呈现相对均匀的分布。当细胞进入有丝分裂期，核膜崩解，NuMA形成小的凝集体，这些凝集体融合形成大的凝集体并沿着微管迅速移动到纺锤体极。通过形态观察，融合分裂，光漂白恢复实验，证明细胞质及纺锤体极上的NuMA凝集体具有液体性质。进一步的体内活细胞实验以及体外相分离实验，证明NuMA的C端结构域主要负责有丝分裂期的相分离。

相分离在细胞中普遍存在，但是它的发生要受到严格的时空调控，使之发生在正确的时间正确的地点执行相应的功能。为了弄清楚NuMA在有丝分裂期发生相分离的调控机制，研究人员将NuMA的入核序列删除掉，使之间期在细胞质内表达，发现NuMA在间期的细胞质仍然处于凝集的状态，证明其仍然具有相分离能力。然而光漂白实验发现间期细胞质内的NuMA凝集体基本不具有流动性，相对于有丝分裂期更接近固体的状态。这提示细胞进入有丝分裂期NuMA的状态受到了调控，使其维持液体的特性。接下来的体内体外实验表明，Aurora A在有丝分裂期对于NuMA的磷酸化可以减弱其相分离的能力并促进其流动性。这使得NuMA在纺锤体极上的凝集也处于可调控的动态交换过程中，控制了NuMA皮层定位的水平，从而调控了纺锤体定向【14】。

液-液相分离作为细胞中一种自组装无膜细胞器的方式，为我们理解生物学现象提供了一个新的切入点。为了进一步研究NuMA如何凝集到纺锤体极上以及NuMA相分离的生理功能，研究者将NuMA蛋白中介导相分离的关键位点进行突变或删除，构建了缺失相分离能力的NuMA突变体。缺失相分离能力的突变体无法凝集到纺锤体极上，而是蔓延到整个纺锤体上，证明了NuMA相分离能力的缺失并未影响NuMA结合微管的能力，而是影响了NuMA在纺锤体极上的凝集。更重要的是，通过与已知驱动相分离的序列融合，也可以部分恢复NuMA相分离的能力，从而部分恢复其在纺锤体极上的定位。那么具有相分离能力的NuMA为何可以定向地凝集在纺锤体的负端而非其他位置呢？研究者进一步通过蛋白结合质谱检索到NuMA可以与kinesin-14家族的成员KifC1结合，KifC1是特异性向微管负端运动的驱动蛋白样蛋白【15】。干涉KifC1后，NuMA的定位向远离纺锤体极的方向迁移，纺锤体极上的凝集定位减弱，提示KifC1可能协助NuMA液滴定位到纺锤体极。但KifC1是否参与NuMA液滴向纺锤体极的运输，还需进一步实验验证。

接着，为了进一步探索NuMA调控纺锤体长度的分子机制，研究者进行蛋白质质谱发现NuMA可以与Kif2A结合。Kif2A在有丝分裂期与NuMA共定位到纺锤体极上。令人惊讶的是，NuMA缺失后，Kif2A不再凝集到纺锤体极上，而是蔓延定位到整个纺锤体上。进一步研究发现NuMA是通过相分离调控了Kif2A在纺锤体上的空间定位，将Kif2A隔离到纺锤体极上，对纺锤体极上的微管进行解聚，从而调控了微管动态性，纺锤体长度以及染色体分离。NuMA在前中期形成液滴并凝集到纺锤体极的现象，也促进了非中心体依赖形成的微管向中心体依赖形成的微管移动和捕捉的过程。

综上所述， 该项工作以NuMA蛋白为研究切入点，阐明了一个纺锤体极上存在的液体样NuMA凝集体通过招募Kif2A调控纺锤体长度和动态性的模型，并揭示了NuMA液体样凝集体的物理状态对于纺锤体长度的影响，这对于理解纺锤体装配的时空调控提供了重要信息。

北京大学生命科学学院张传茂教授为本论文的通讯作者，张传茂实验室博士研究生孙梦杰为本论文第一作者，实验室多位老师和同学对此项工作做出了贡献。

实验室介绍

张传茂：

北京大学生命科学学院教授，国家杰出青年基金获得者，国家基金委”创新研究群体“学术带头人，科技部干细胞专项首席，全国优秀科技工作者，全国模范教师，国家自然科学奖二等奖，全国高校科学技术奖一等奖和北京大学拜耳学者奖。

实验室研究领域：

张传茂教授实验室长期以来主要以细胞生物学、分子生物学和生物化学方法技术等为研究手段，以培养细胞，小鼠、非洲爪蟾、果蝇等为主要实验材料，在分子、亚细胞、细胞、组织和个体水平上，从事干细胞增殖与分化、细胞周期调控（包括纺锤体装配和核膜装配机理等）、细胞核结构、细胞核动态变化及功能、Ran GTP酶功能调控、肿瘤细胞增殖调控等方面的研究。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-021-27528-6

‍制版人：十一

参考文献

1. Akhmanova, A. & Steinmetz, M.O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol 16, 711-726 (2015).

2. Petry, S. Mechanisms of Mitotic Spindle Assembly. Annu Rev Biochem 85, 659-683 (2016).

3. Kwok, B.H. & Kapoor, T.M. Microtubule flux: drivers wanted. Curr Opin Cell Biol 19, 36-42 (2007).

4. Rogers, G.C. et al. Two mitotic kinesins cooperate to drive sister chromatid separation during anaphase. Nature 427, 364-370 (2004).

5. Manning, A.L. et al. The kinesin-13 proteins Kif2a, Kif2b, and Kif2c/MCAK have distinct roles during mitosis in human cells. Mol Biol Cell 18, 2970-2979 (2007).

6. Jang, C.Y. et al. DDA3 recruits microtubule depolymerase Kif2a to spindle poles and controls spindle dynamics and mitotic chromosome movement. J Cell Biol 181, 255-267 (2008).

7. Ems-McClung, S.C. & Walczak, C.E. Kinesin-13s in mitosis: Key players in the spatial and temporal organization of spindle microtubules. Semin Cell Dev Biol 21, 276-282 (2010).

8. Goshima, G. & Scholey, J.M. Control of mitotic spindle length. Annu Rev Cell Dev Biol 26, 21-57 (2010).

9. Fu, J. et al. TPX2 phosphorylation maintains metaphase spindle length by regulating microtubule flux. J Cell Biol 210, 373-383 (2015).

10. Sanders, D.W. et al. Competing Protein-RNA Interaction Networks Control Multiphase Intracellular Organization. Cell 181, 306-324 e328 (2020).

11. Alberti, S., Gladfelter, A. & Mittag, T. Considerations and Challenges in Studying Liquid-Liquid Phase Separation and Biomolecular Condensates. Cell 176, 419-434 (2019).

12. Jiang, H. et al. Phase Transition of Spindle-Associated Protein Regulate Spindle Apparatus Assembly. Cell 163, 108-122 (2015).

13. So, C. et al. A liquid-like spindle domain promotes acentrosomal spindle assembly in mammalian oocytes. Science 364, eaat9557 (2019).

14. Gallini, S. et al. NuMA Phosphorylation by Aurora-A Orchestrates Spindle Orientation. Curr Biol 26, 458-469 (2016).

15. She, Z.-Y. & Yang, W.-X. Molecular mechanisms of kinesin-14 motors in spindle assembly and chromosome segregation. J Cell Sci 130, 2097-2110 (2017).

（可上下滑动阅览）

转载须知

【非原创文章】本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，作者拥有所有法定权利，违者必究。