专家点评 | 田长麟/刘磊合作阐释激动剂或正向别构调节药物高选择性激活阿尔兹海默症相关α7尼古丁型乙酰胆碱受体的结构机制

点评 | 蒋华良（中科院上海药物所）、高召兵（中科院上海药物所）、申勇（中科大）

尼古丁型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）是一类Cys-loop家族的配体门控五聚体离子通道（pentameric ligand-gated ion channels，pLGIC），是神经系统中重要的神经递质受体。α7乙酰胆碱受体是人脑中丰度最大的亚型之一，富集在与学习记忆相关的脑区，在突触前膜、突触后膜和突触周围的膜上都有分布。α7通常以同源五聚体的形式发挥功能，在神经递质乙酰胆碱的激活下产生快速脱敏的阳离子电流。与其他亚型乙酰胆碱受体不同，α7对钙离子有较高的通透性，它的激活可以调控细胞内钙离子浓度，进而影响多种生理过程。

α7功能异常被认为与多种神经系统相关疾病的发生密切相关，如阿尔兹海默病(AD)、认知障碍、精神分裂症等（图1）【1】。研究发现，在AD病人和精神分裂症患者的大脑中α7显著减少；而增强α7的作用在一定程度上能够改善认知功能，因此增强α7活性被认为是治疗AD和精神分裂症等神经系统疾病的有效策略。有证据表明淀粉样蛋白Aβ1-42可以高亲和力的结合α7并影响其功能。α7的激动剂能够激活受体，而正向别构调节剂（positive allosteric modulators，PAM）能不同程度地增强α7的电流，它们已成为α7相关疾病治疗药物研发的重要方向。

图1. α7受体的功能和相关疾病【1】

EVP-6124是α7的部分激动剂，电生理实验表明EVP-6124能选择性的激活α7，而对α4β2、α3β4等亚型没有激活作用。EVP-6124对α7具有很高的亲和力，比天然的配体乙酰胆碱要强300倍。EVP-6124作为α7选择性激动剂被用于临床药物开发【2】。

α7的PAM能增大激动剂引发的电流，根据其是否会影响受体的脱敏又被分成type-I和type-II两种类型。Type-I的PAM只增大激动剂引起的峰值电流而不影响受体的脱敏，同时也不能引起脱敏状态的通道开放；而type-II的PAM，既能在增大峰值电流的同时延缓通道脱敏，也能使脱敏状态的通道再次开放。PNU-120596是第一个被发现具有α7选择性的type-II PAM药物【3】。

目前，对α7的功能和药理学性质已有广泛的研究，但α7的结构信息知之甚少。α7结构方面的认知主要还是来自于α7-AChBP嵌合体胞外域晶体结构和α7跨膜区的NMR结构，以及其他亚型乙酰胆碱受体的结构（α4β2-和α3β4-nAChR，muscle-type Torpedo AChR）。实际上，不同亚型的乙酰胆碱受体具有不同的生理功能和特性，但它们的正构位点都是由一些相对保守的芳香族氨基酸组成的疏水口袋，因此鉴定序列和结构上有差异的氨基酸将是影响激活机制的关键因素。此外，PAM在α7上的结合位置尚不明确，PAM的别构调节机制目前还不够清晰。这些问题都需要完整的α7以及α7-配体复合物的高分辨率结构来解答。

近日，中国科学技术大学田长麟课题组与清华大学刘磊课题组合作，在Cell Research杂志上发表了题为 Structural basis of human α7 nicotinic acetylcholine receptor activation 的研究论文。该论文报道了人源全长α7受体在三种状态下的冷冻电镜三维结构（图2）：不添加任何配体的（apo form）的resting状态结构（3.18 Å）；结合激动剂（EVP-6124）的脱敏状态结构（2.85 Å）；同时结合激动剂（EVP-6124）和正向别构调节剂 (PNU-120596)的部分脱敏状态结构（3.02 Å）。

图2. 人源全长α7受体在三种不同状态下的冷冻电镜三维结构

激动剂EVP-6124对α7乙酰胆碱受体具有选择性的结构基础：冷冻电镜结构表明，EVP-6124结合在α7胞外域的正构位点上，但是，它在α7受体中的空间取向与尼古丁在其他亚型nAChRs中的取向显著不同。尼古丁分子朝向结合口袋内部，而EVP-6124朝向外部，它们之间形成了约90°的角度差异。进一步对结合部位的氨基酸残基进行比较，发现EVP-6124与尼古丁在神经型nAChRs的正构位点上以几乎相同的主面和不同的互补面结合（图3）。结合口袋中互补亚基的氨基酸差异性可能决定了激动剂的亚型选择性。

图3. 激动剂EVP-6124选择性结合α7乙酰胆碱受体的结构基础

正向别构调节剂PNU-120596对α7乙酰胆碱受体具有选择性的结构基础：PNU-120596结合在跨膜结构域的上半部，位于两个相邻亚基的界面处，这是首次有关PAM结合α7的位置报道。结合口袋的氨基酸位于主亚基上的M2、M3螺旋和M2-M3 loop上，以及互补亚基的M1和M2螺旋上，它们之间的主要是疏水相互作用。比较结合口袋位置其他nAChRs亚型（如α4β2和α3β4）的氨基酸，发现M2上的M276和M3上的A298分别被由Leu和Ile替代，这些被替代的氨基酸与PNU-120596分子之间存在明显的空间位阻作用。因此，M2和M3跨膜螺旋的氨基酸残基多样性可能决定了PNU-120596对不同亚型受体的选择性。

图4. 正向别构调节药物PNU-120596选择性结合α7乙酰胆碱受体的结构基础

激动剂EVP-6124激活α7乙酰胆碱受体的结构基础：EVP-6124结合导致受体胞外域的loop C发生明显构象变化，而跨膜结构域的构象变化主要发生在M2螺旋和post-M3 loop上。这种构象变化主要是通过胞外域与跨膜螺旋束之间的耦联区域（包括β1-β2 loop，Cys-loop，pre-M1 loop和M2-M3 loop等）进行传递（图5）。激动剂结合之后，结合口袋附近结构的变化通过耦联区进行构象传递，最终引起M2跨膜螺旋上半部发生向上移动和向外旋转，导致通道的上半部孔道区发生扩张，而下半部孔道区结构无明显变化，通道处于脱敏状态。

图5 选择性激动剂EVP-6124激活α7乙酰胆碱受体的结构基础

正向别构调节剂PNU-120596通过变构效应激活α7乙酰胆碱受体的结构基础：PNU-120596的结合对受体整体结构影响不大。然而，非常重要的一点是，它的结合引起位于结合口袋下方M2跨膜螺旋上的9'-Leu（Leu270）侧链向外旋转约110°。与只跟激动剂结合的受体结构相比，PNU-120596结合后，受体的上半部孔道区的开放程度变大，而孔道下半部几乎保持不变，维持了通道的脱敏或者部分脱敏状态。

图6. 正向别构调节剂PNU-120596通过变构效应激活α7乙酰胆碱受体的结构基础

近期，美国德克萨斯西南医学研究中心的Hibbs研究组在Cell杂志上发表了题为Structure and gating mechanism of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor的研究论文。该文运用冷冻电镜技术分别解析了α7与拮抗剂α-bungarotoxin，α7与激动剂epibatidine，以及α7与epibatidine和PNU-120596的复合物结构，这三个结构分别代表了α7的静息、脱敏和开放状态[4]。通过与此文中的结构比对发现，尽管这两项工作使用了不同的配体分子，apo-form的静息状态结构和α-bungarotoxin结合的静息状态结构高度类似（RMSD=1.00Å）；EVP-6124结合的脱敏状态结构和epibatidine结合的脱敏状态结构同样类似（RMSD=0.81Å）。由于epibatidine也是一种非选择性激动剂，它与EVP-6124的空间取向也是形成了约90°的差异（图7）。

图7. 不同激动剂与α7乙酰胆碱受体结合位置的比较

然而，EVP-6124/PNU-120596结合的α7处于一种部分脱敏的状态，而epibatidine/PNU-120596结合的α7处于一种完全开放的状态，这表明PAM与不同类型的激动剂（部分激动剂或完全激动剂）协同作用，会对α7的功能状态产生不同的效果。该 Cell 论文解析了α7与epibatidine/ PNU-120596的复合物结构并捕获了α7的开放状态构象，但在该结构中无法观察到PNU-120596分子，因而无法揭示PAM调控α7活性的结构机制。

综上，田长麟/刘磊合作报道的研究结果展示了不同配体结合状态下α7乙酰胆碱受体原子分辨率的三维结构，清楚地揭示了激动剂和正向别构调节剂（PAM）与α7的结合模式及选择性的结构基础，同时也揭示了α7受体激活的分子机制。作为独立开展的研究工作，田长麟/刘磊组与Hibbs组的研究结果高度互补，揭示α7受体的配体激活机制，将为靶向α7受体的药物开发提供重要的结构信息。

图8 不同状态下α7乙酰胆碱受体的孔道区

本研究工作由中国科学技术大学的田长麟团队和清华大学的刘磊团队通力合作共同完成。中国科学技术大学生命科学学院的博士研究生赵越、副研究员刘三玲和博士研究生周颖欣为论文的共同第一作者，中国科学技术大学的田长麟教授、孙德猛副研究员、刘三玲副研究员和清华大学的刘磊教授为本文的共同通讯作者，中科院上海药物所徐华强研究员给予了非常宝贵的指导意见。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41422-021-00509-6

专家点评

专家一（蒋华良  中国科学院院士、中国科学院上海药物研究所 研究员）

尼古丁型乙酰胆碱受体（nAChR）是五聚体配体门控离子通道家族成员。神经型nAChRs是神经系统中重要的神经递质受体，通常以同源或异源五聚体的形式存在，它们参与了乙酰胆碱介导的中枢和外周神经系统信号传导。迄今为止，神经型nAChRs家族中有3个成员的结构被解析，除了本研究和最近Hibbs团队在Cell 报道的α7-nAChR之外（非常遗憾，该项研究成文略慢一些），α4β2-nAChR（Nature 2016, Nature 2018），α3β4-nAChR（Neuron 2019）的三维结构都相继被解析。

图1. 神经型nAChRs的分类和α7亚型介导的神经传递

田长麟团队和刘磊团队通过逐步优化人源α7-nAChR在哺乳动物细胞HEK293中的表达条件，最终获得了正确折叠的具有配体门控离子通道功能的蛋白。该项研究共解析了三种不同条件下的全长α7-nAChR受体结构: apo-状态，激动剂EVP-6124(临床研究药物)和II型正向别构调节剂PNU-120596（临床研究药物）。并通过结构比较，结合前期的大量生理与药理研究数据揭示激动剂EVP, 正向别构调节药物PNU特异性结合并激活α7-nAChR功能的结构基础。

由于前期国际、国内多个实验室在α7-nAChR的结构研究中均没有成功，我一直关注田长麟和刘磊的这项工作，并特别提醒田长麟在蛋白表达、纯化和样品制备过程中关注蛋白质的翻译后修饰。尤其前期功能研究表明，α7-nAChR的糖基化会影响金环蛇毒素结合并抑制受体的功能。研究人员尝试了昆虫细胞、哺乳动物细胞等表达条件，最终HEK293细胞制备的蛋白质能获得高质量的电镜数据。在样品纯化和电镜样品制备中，研究人员尽可能减少蛋白质翻译后修饰的影响。在冷冻电镜结构解析过程中，研究人员仔细分析了电镜密度数据，在α7-nAChR的胞外结构域能观察到对称性分布的额外非氨基酸电子密度。结合附近氨基酸位点的确认，能推测是糖基化位点，包括N46位点的单糖基化，N133位点的双糖基化。同时，在α7-nAChR的跨膜区下部，能清晰看到与M3、M4及MX螺旋紧密接触的额外电子密度。经分析和密度匹配，被认为是紧密附着在跨膜孔道区外侧的胆固醇分子。在跨膜孔道区上半部分的外侧，还能观察到M3，M4外侧的多余电子密度，推测为磷脂分子。当然，这部分研究还需继续深入，才能得到可靠的结论。

在α7-nAChR的胞内结构域（ICD）的下部的中轴线部分，能观察到致密的额外非氨基酸电子密度，被ICD的多个疏水氨基酸（I436, V440, I443, F447）所环绕。该致密电子密度带，被认为是“疏水塞子 hydrophobic plug”,具备堵住阳离子从α7-nAChR下部流出，而只能从ICD的侧面空隙流出。相关现象在前期报道的α3β4-nAChR及肌肉型AChR结构中也有报道。

图2. α7乙酰胆碱受体的结构(a)和糖基化位点修饰(b)，附着在跨膜区外侧的胆固醇分子和修饰磷脂(c),以及在胞内区下部发现的非氨基酸致密电子密度（d）

这项工作再一次表明，冷冻电镜技术的发展，在揭示蛋白质精细三维结构的同时，能获得这些蛋白质的化学修饰位点和修饰类型。在精细三维结构基础上的的化学修饰分析，特别是分析该化学修饰对蛋白质结构的影响，将为进一步揭示蛋白质化学修饰对蛋白质的功能影响和机制提供重要线索（详见BioArt报道：学者笔谈丨蒋华良：冷冻电镜结构测定发现G蛋白偶联受体信号传导的新化学修饰）。

专家点评

高召兵 研究员，中科院上海药物所神经精神疾病研究中心主任

中国科学技术大学田长麟团队和清华大学刘磊团队两个课题组合作，应用冷冻电镜技术结合细胞功能实验，解析了人源全长α7尼古丁型乙酰胆碱受体（α7-nAChR）在三种不同状态下的三维结构。尼古丁型乙酰胆碱受体（nAChR）最早作为筒箭毒碱的受体被人们所熟知，自发现之日起其药理学研究即备受关注，是最重要的离子通道型受体之一。α7-nAChR是nAChR的一个重要亚型，是多种神经系统疾病的潜在靶点，其配体的选择性和作用机制是药物研发过程中需要考虑的重要问题。

作为极具潜力的药物靶点，目前有多个α7-nAChR的小分子配体（主要是激动剂和正向别构调节剂PAM）处于不同研发阶段，部分获准开展临床试验，其适应症包括精神分裂症、阿尔茨海默氏症等。EVP-6124是FORUM制药开发的试验性新药，是一种选择性作用于α7-nAChR的部分激动剂。EVP-6124的II期临床试验结果表明能够有效改善精神分裂症患者的认知状况及功能水平。III期临床试验中，虽然EVP-6124的安全性和耐受性很好，但在疗效上未达到预期效果而被宣布失败。PNU-120596是辉瑞制药开发的第一个选择性作用于α7-nAChR的II型PAM。尽管这种化合物增强了乙酰胆碱酯酶抑制剂对啮齿动物和非人灵长类动物的认知作用，但由于过高的钙内流导致的潜在毒性作用，它未能进入临床试验。

田长麟等这项工作揭示了上述两种配体激活α7-nAChR的结构基础，并首次揭示了II型PAM在α7-nAChR上的结合位置，阐明了激动剂和PAM结合口袋部位的具体氨基酸残基对于其特异性结合的重要性。这些结果对于后续针对α7-nAChR的药物设计和研发提供了重要的结构基础和依据。值得注意的是，近期美国德克萨斯西南医学研究中心的Hibbs研究组也解析了α7-nAChR与另一个激动剂／PAM组合（epibatidine/ PNU-120596）的复合物结构，并捕获了通道受体的开放状态构象。田长麟研究组的结构中PNU-120596的电子密度清晰可见，位于上半部跨膜区，它的结合使上半部孔道区开放更大，而孔道下半部仍是关闭；与此对应的是，Hibbs研究组的结构中没有观察到PNU-120596分子，且孔道均是开放的。两项工作显示的结构差异是否由于激动剂不同抑或不同激动剂／PAM组合造成的值得深入研究。

离子通道是最重要的的药物靶点家族之一。靶向离子通道的药物研发较其它类型靶点药物相比，需采用专门设备评价药物对离子通道电流的影响，技术相对独特，如何同时实现高通量和准确性一直存在挑战。与直接的孔道阻断剂、竞争性抑制剂或激动剂相比，离子通道的“别构调节剂”被认为可能具备高选择性和低毒性等优势。除GABA、NMDA、AMPA等多个重要配体门控离子通道外，一些电压门控离子通道如KCNQ钾通道等，其小分子调节剂的药物研发也取得了重要进展。小分子配体与α7-nAChR的结构解析，特别是精确的PAM的结合口袋的确定，是该类型离子通道研究的重要进展，可推动α7-nAChR的PAM由偶然发现向基于结构的设计，对于靶向α7-nAChR的药物研发具有重要价值。

专家点评

申勇 教授，中国科学技术大学神经退行性疾病研究中心，中科大第一附属医院脑衰老脑疾病研究中心主任

阿尔茨海默病（Alzheimer‘s Disease, AD），俗称老年痴呆，临床表现为进行性记忆损伤、认知障碍、精神症状以及日常生活能力的丧失。目前，全球约有5000万痴呆患者，其中60%~80%左右为AD患者，但至今仍无延缓或治愈疾病的药物。病理研究发现AD大脑前额叶皮层的胆碱能神经元受到损伤，导致认知功能逐渐消退。人们最早开发出胆碱酯酶抑制剂希望能保留更多的乙酰胆碱使受损的胆碱能神经元恢复其功能，但临床效果非常有限。后来人们通过提高脑内乙酰胆碱的尼古丁受体功能使神经元发挥更大的功能，如美国雅培公司开发的尼古丁受体第3亚型（α3受体）激动剂ABT481，对动物的学习记忆有不错的促进作用，但临床III期试验最终还是失败了。近年来人们克隆了尼古丁受体第7亚型（α7 nAChR）并在药理学方面发现激活α7受体能促进学习和记忆。

EVP-6124 是选择性激活 α7 nAChR 的最具代表性候选药物，但FDA 在对其治疗AD的III期临床试验中报告了由于未明确的原因引起胃肠道副作用，宣布中止其III期临床试验。田长麟和刘磊团队的结构研究表明，激动剂EVP-6124结合条件下，α7-nAChR通道处于脱敏状态（而不是维持开放状态）。是否该脱敏状态是导致EVP-6124的III期临床失败的主要原因，还需要进一步从结构、功能等方面比较其他激动剂对α7-nAChR脱敏状态的动力学过程。

PNU-120596是靶向α7-nAChR的高选择性且能延缓脱敏效应的的正向别构调节剂(PAM)。田长麟和刘磊团队的研究结果表明EVP/PNU结合的α7-nAChR也处于一种部分脱敏的状态，而近期报道的非选择性激动剂epibatidine与PNU结合的α7-nAChR处于一种完全开放的状态 (Cell, 2021, 184:1-14)，这表明PAM与不同类型的激动剂协同作用，会对α7的功能状态产生不同的效果。

因此，不同激动剂（非选择性或选择性，部分或完全）与PAM对α7-nAChR的协同作用的差异，将成为靶向α7-nAChR药物研发的新方向。期待靶向α7-nAChR的不同类型激动剂，不同类型正向别构调节剂的筛选、优化和药物研发，能加速推动减缓乃至治疗AD等认知退化老年疾病的药物研发进程。

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制版人：十一

参考文献

1. Corradi, J. and C. Bouzat, Understanding the Bases of Function and Modulation of alpha7 Nicotinic Receptors: Implications for Drug Discovery. Mol Pharmacol, 2016. 90(3): p. 288-99.

2. Prickaerts, J., et al., EVP-6124, a novel and selective alpha7 nicotinic acetylcholine receptor partial agonist, improves memory performance by potentiating the acetylcholine response of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors. Neuropharmacology, 2012. 62(2): p. 1099-110.

3. Hurst, R.S., et al., A novel positive allosteric modulator of the alpha7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor: in vitro and in vivo characterization. J Neurosci, 2005. 25(17): p. 4396-405.

4. Noviello, C.M., et al., Structure and gating mechanism of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor. Cell, 2021. 184(8): p. 2121-2134 e13.

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