柯萨奇病毒A组6型所致手足口病研究进展

       柯萨奇病毒A组6型（coxsackievirus A6, CA6）是引起疱疹性咽峡炎及手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)的主要病毒之一，临床症状包括广泛性皮疹、迟发性脱皮、脱甲症等。近年来，CA6感染已成为成人HFMD的主要原因。目前尚无有效治疗CA6感染的药物，但随着关注度的不断提高，相关流行病学和疫苗等方面的研究取得了一定的进展，这些成果将在HFMD的预防和控制中发挥重要作用。此文就CA6的病原学、分子流行病学、临床特征及疫苗相关的研究进行综述。

       柯萨奇病毒A6型；手足口病；疫苗

     手足口病（hand-foot-mouth disease, HFMD）是由多种肠道病毒（enterovirus, EV）感染引起的常见传染病，主要病原包括柯萨奇病毒A组（coxsackievirus A, CA）4—7、9、10、16型和B组1—3、5型，埃可病毒的部分血清型和EV71等，其中CA16和EV71为主要病原体^[1]，但从2013年开始，我国报告的HFMD病例中CA6感染者的占比迅速上升，CA6已超过EV71和CA16成为HFMD的主要病原体。近年来，CA6的实验室诊断和疫苗研发等方面取得了一定进展，对预防和控制CA6血清型相关HFMD具有十分重要的作用。

       CA6属小核糖核酸病毒科肠道病毒属A组，呈二十面体球型，无包膜，为单股正链RNA，基因组全长约7 400 bp，包含1个开放阅读框及5′和3′非编码区^[2] 。CA6具有EV的一般理化特性，耐低温耐酸，但可在高于56 °C的温度下失去活性，对干燥、紫外线和氧化剂较敏感。目前我国主要流行的是重组进化后的CA6新型变异株^[3-5]，毒力增强的原因可能是结构蛋白VP1的8个氨基酸位点发生改变^[6]。

       2008年以前，CA6感染多与疱疹性咽峡炎（herpangina, HA）相关。2008年秋季芬兰HFMD暴发和2011—2012年西班牙HFMD暴发中，CA6均为主要病毒株^[7-8]。法国2014年4月至2015年3月门诊就诊的儿童患者中共监测到2次HFMD流行，主要病毒株也为CA6^[9]。在亚太地区，2008年新加坡暴发的HFMD中CA6和CA10感染所占比例为35.3%^[10]；2017年日本报道了由CA6导致的HFMD流行，与1999—2009年间分离的毒株相比，2011—2015年CA6在VP1的DE、EF、GH环上发生了特异性氨基酸替换^[11]；2013—2015年越南报道的1 547例HFMD中CA6感染病例占21.8%^[12]。

       2013年以来，在北京、上海、深圳等地流行的HFMD中，CA6已超过EV71和CA16已成为引起HFMD流行的主要病原（表1）^{[3, 13-16]}。

       目前，尚无统一的CA6基因分型标准，其原因或为：（1）使用分析软件与版本不同。（2）纳入分类的序列数量及来源不同。（3）仅对VP1基因序列进行分析，存在局限性。对CA6的分型方式包括A—D、A—E、A—F和A—G基因型等，其中A—D分型方式较为普遍。

      Song等^[17]使用MEGA 5.0软件对1992—2015年中国807株CA6的VP1基因进行了序列分析（VP1包含血清型特异性信息，常用于EV鉴定和系统发育分析），将CA6分为A、B、C和D 4个基因型，其中B、C、D基因型又可进一步分为B1—B2、C1—C2、D1—D3亚型。2008—2010年欧洲HFMD流行可归因于D1和D3亚型感染，同时D3亚型是导致2010年以后HFMD全球流行的主要原因。He等^[6]使用MEGA 5.1软件对2009—2015年中国1 868株CA6 VP1序列进行系统发育分析，并与国际参考CA6病毒株进行比较，发现D基因型可进一步分为D1—D5 这5个亚型，其中D5亚型又可进一步划分为4个谱系。2013年之前，D1亚型和D4亚型的第1—3谱系在厦门地区共流行，而2013—2015年，导致厦门地区HFMD流行的主要原因是D5亚型的第4谱系。

        Bian等^[18]对全球范围内43株代表性CA6的VP1序列进行系统发育分析，结果将CA6分为A—E 5个基因型，E基因型又可进一步分为E1和E2亚型。B和C基因型主要在上世纪90年代的亚洲流行；自2008年以来，E2亚型逐渐成为HFMD流行的主要病毒株。2009—2011年，广东省D基因型和E2基因亚型共流行，2011年之后，E2亚型为主要流行株。在欧洲也有类似的趋势，2008年以后芬兰发生的HFMD大流行中，CA6由D型转变为E型。2008—2010年间E1和E2亚型则在西班牙和法国发生共流行。E2亚型在世界范围内逐渐成为CA6所致HFMD的主要基因型。

       Li等^[14]使用MEGA 5.0软件对55株具有代表性的中国及国外CA6 VP1基因序列进行系统发育分析，结果可分为A—F 6个基因型，2008—2011年从广东省及其他地区分离的CA6可归为A和D两个基因型，2012—2013年广东省和上海市HFMD流行期间分离的几乎所有CA6均为A基因型，并显示与2009/2010年中国台湾株、2010年法国株和2011年日本株具有密切遗传关系。

      Zeng等^[19]使用Bioedit 7.2软件对2008—2013年广东省163株CA6 VP1序列进行系统发育分析，结果分为A—G 7个主要基因型。在2012—2013年HFMD流行期间，广东、上海、江苏、山东和福建等地所有CA6分离株都被归为A基因型，且与2008芬兰株、2009/2010中国台湾株、2010法国株和2011日本株关系密切。

       HFMD典型临床症状包括咳嗽，发热，手、足、口、臀部位出疹，食欲不振，流涎等。部分患者仅表现出HA症状，少数会出现中枢神经系统受损，表现为精神萎靡、易惊、抽搐等。重症病例临床表现为心率和呼吸增快、脑功能衰竭、血压降低或休克等^[1]。非典型HFMD(atypical HFMD, aHFMD)主要由CA6引起，临床表现包括非典型部位或全身性的皮疹，脱皮、脱甲症以及成人感染等不同临床症状可能与病毒基因重组有关^[19]。

2.1.1  非典型部位出疹  HFMD患者在发热1～2 d后可在口腔黏膜出现分散的粟粒大小的水疱，手、足、臀等部位出现红色小斑丘疹、疱疹。CA6所致aHFMD病症除典型部位外，还常在四肢、躯干等其他部位出疹。Mathes等^[20]对2011年至2012年北美80例aHFMD进行了回顾性研究，其中17例检出感染CA6，皮疹除了累及足底、手掌和臀部等典型部位外，还出现在口周、四肢和躯干等部位。Chung等^[21]对21例水疱性皮肤病患者进行病原检测，结果有6例检出CA6，主要临床表现为早期四肢、面部、躯干多发至广泛的中心性紫癜样非典型病变，晚期发展为带紫色基底的大水疱，出现轻度至中度口唇湿烂。

2.1.2  脱皮、脱甲症   2017年报道的湖北20例HFMD均出现指甲脱落，其中4例甲内存在博氏线^[22]。Chiu等^[23]在2010—2016年中国台湾11例脱甲症患者的指甲样品中检测出CA6，这些患者还出现了迟发性足底脱皮症状。2019年，巴西贝伦报道了40例由EV引起的HFMD病例，其中36例出现手掌和脚底脱皮，12例出现指甲脱落，18份病例临床样品中检测出CA6^[24]。

       由于戊型肝炎病毒感染也可引起脱甲症，因此脱甲症是由CA6单独引起还是由多种病毒共同引起还有待研究。此外，脱甲症状与HFMD严重程度无相关性。脱甲、脱皮症常为迟发性症状，因此相关临床报道大多为回顾性研究。

2.1.3  成年人发病    2008年芬兰首次出现的CA6感染暴发流行中就存在成年人发病病例，此后，世界各地相继有成年人感染CA6的报道。2014—2016年，在意大利热那亚的10例aHFMD成年重症患者临床样本中均检测出CA6，这些病例主要临床表现为发热、全身严重血管炎样皮疹和黏膜疹，分别于发病后1~3周内自行恢复^[25]。美国休斯敦的1家皮肤科门诊在2012—2013年间接诊了5位感染CA6的成年患者，所有患者的临床表现与HFMD各阶段一致，其中1例患者出现迟发性指甲脱落和手掌、脚底脱皮^[26]。

       基因重组一直被认为是EV进化与流行的驱动力，研究表明，重组的CA6更易引发aHFMD。Feng等^[3]在2012年11月上海暴发的CA6相关HFMD中发现了1个重组CA16单谱系，占研究期间CA6分离株的21.9%，通过Simplot和Bootscan分析发现重组发生在基因组2C区，重组片段与2010年上海流行的CA4(1047/CVA4/SH/CHN/2010株)具有高度同源性，临床统计结果表明，重组病毒更易引发广泛性皮疹。Nikolaidis等^[4]通过对2 949个完整的EV基因组序列进行分析，发现CA6与EV71基因重组较为频繁，其中2A、2B、2C区重组频率较高。值得注意的是，25%的重组序列片段与公共数据库中已知的EV序列并不一致，提示环境中可能存在一个相当大的基因库，会促进基因重组并加速新型EV的流行。Gaunt等^[5]对2014年从爱丁堡疱疹性湿疹患者和2008年从HFMD患者中收集的CA6分离株进行基因特征分析，发现2A—2C、VP3区、VP1区与5′非翻译区之间均存在重组断裂点，统计结果也显示基因重组与HA、aHFMD和疱疹性湿疹等临床表现相关。

       单价或多价CA6相关疫苗目前均处于临床前研究阶段，主要分为灭活疫苗和基因工程疫苗两类，其中基因工程疫苗包括病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）疫苗和亚单位疫苗。

      Zhang等^[27]研制的CA6/CA10二价灭活疫苗可诱导特异性的系统免疫应答，以保护小鼠免受致死性病毒攻击。皮下注射疫苗能诱导成年雌性小鼠产生高水平的中和抗体。母源抗体在控制CA6和CA10的同型和异型感染及体内病毒复制方面起重要作用，表明两种抗原在诱导病毒特异性免疫应答方面没有免疫干扰。小鼠免疫保护试验结果显示，接种了甲醛灭活二价疫苗的小鼠在CA6/CA10联合攻击后，中和抗体滴度分别为1:24和1:21，保护率可达80%。

      美国Wisconsin-Madison大学研究团队研制了三价HFMD乙烯亚胺灭活疫苗（EV71/CA16/CA6），肌内注射产生的抗体（中和抗体滴度分别为1:485、1:285、1:1 436）对3周龄小鼠EV71、CA16、CA6分别致死攻击的保护率均为100%^[28]。

       韩国国立卫生研究院研发团队分别利用甲醛和β-丙内酯灭活制备了三价CA候选疫苗（CA6/CA10/CA16），肌内注射β-丙内酯灭活三价疫苗的小鼠在CA6、CA10、CA16攻击后中和抗体滴度为>1:256、>1:32、>1:32，保护率分别可达到96.2%、100.0%、59.1%，免疫效果优于甲醛灭活方法^[29]。

      Liu等^[30]利用甲醛灭活方法制备的四价灭活EV候选疫苗诱导的抗EV71、CA16、CA6和CA10中和抗体滴度分别为1:708、1:22、1:100和1:16，但对于实验动物的免疫保护率未知。

       Zhou等^[31]利用毕赤酵母系统共表达CA6 P1和3CD蛋白，P1被3CD酶切割成VP0、VP1和VP3三个亚单位蛋白，随后组装成CA6 VLP。经蔗糖密度梯度离心后进行电子显微镜观察，观察到CA6 VLP为直径约30 nm的球形颗粒，按照1 μg CA6 VLP/500 μg氢氧化铝佐剂的比例配制成试验疫苗，分别于第0、2、5周通过腹腔注射途径接种6周龄ICR小鼠，免疫小鼠血清IgG抗体几何平均滴度为1:17 959。将CA6 VLP免疫血清腹腔注射1周龄ICR小鼠，1 d后进行致死剂量CA6攻击，保护率达100%。

       Shen等^[32]利用昆虫杆状病毒系统表达制备 CA6 VLP，分别于第0、2、4周通过腹腔注射途径接种8周龄BALB/c小鼠，免疫小鼠血清IgG抗体几何平均滴度为1:179 594，新生小鼠第1天和第7天用CA6 VLP疫苗免疫2次，第14天进行致死剂量攻击，保护率为100%。

      Zhang等^[33]采用昆虫杆状病毒系统分别表达制备EV71、CA16、CA10和CA6 VLP，按照1 μg VLP/500 μg氢氧化铝佐剂的比例配制，再将4种疫苗按等比组合，单次注射剂量为50 μl，分别于第1天、第21天通过腹腔注射途径接种成年BALB/c小鼠，小鼠血清EV71、CA16、CA6、CA10中和抗体滴度分别为1:1 825、1:4 598、1:228、1:362。将抗EV71/CA16/CA6/CA10 VLP免疫血清腹腔注射6日龄ICR小鼠，1 d后进行致死剂量的EV71/CA16/CA6/CA10攻击，结果发现该免疫血清对4种病毒共感染的保护率为92%。

      Deng等^[34]通过分析5种EV（EV71、CA16、CA10、CA6和柯萨奇病毒B组3型）的蛋白序列，筛选出高度保守且免疫原性强的B细胞、Th、CTL抗原表位，利用连接肽将佐剂50S核糖体蛋白 L7/L12和候选表位顺序连接，对疫苗进行二级结构分析及三级结构同源建模、二硫键设计、修复和验证，最后用计算机模拟克隆选择高表达载体，制备多价抗原表位疫苗（5VA）。第0、1、2周腹腔注射接种6~8周龄BABL/c小鼠，体外中和试验结果显示，免疫小鼠血清对EV71和柯萨奇病毒B组3型有显著的中和作用，但对CA16中和作用不显著，对CA6、CA10的中和作用未知。

       HFMD是危害全球儿童健康的重要疾病，目前我国多地HFMD病原谱系已发生改变，CA6逐渐占据主导地位，由CA6感染引起的aHFMD临床治疗较为困难，而目前尚无有效治疗药物。

       2015年底，EV71灭活疫苗在我国获批上市，填补了HFMD疫苗的空缺，然而引发HFMD的病毒抗原复杂多样，且不同病原间无交叉免疫保护性，不利于HFMD的全面控制。目前，研究人员致力于HFMD多价疫苗的研发，其中灭活疫苗和VLP疫苗为主要研究方向，亚单位疫苗也有相关研究但数据相对较少。从已发表的疫苗免疫动物研究结果看，无论是单价还是多价疫苗均可诱导较明显的免疫应答，但由于不同病原间的免疫竞争关系，多价疫苗免疫动物后诱导产生的中和抗体滴度均不及单价疫苗，因此多价疫苗的配比、佐剂研发成为未来疫苗研究的关注重点。同时由于包括CA6在内引起HFMD的病原均存在多个基因亚型，虽然已上市的C4基因亚型EV71灭活疫苗对其他基因型/亚型毒株表现出较好的体外交叉中和作用，但人群交叉保护效果仍待进一步证实。从CA6病原流行病学研究结果看，CA6也存在多个基因型，且基因重组发生频率较高，流行基因型的监测及不同病毒株间交叉免疫原性的研究也应为CA6疫苗研究关注的重点。同时，需进一步加强HFMD病原流行病学监测力度，及时了解HFMD病原谱系变化趋势，以指导多价疫苗靶抗原类型的选择，从而达到全面控制HFMD的目的。

参考文献（略）

雷富植¹综述   李秀玲²审校

¹国药中生生物技术研究院有限公司第二研究室，北京 101111；²上海生物制品研究所有限责任公司 200051

通信作者：李秀玲，

Email: lixiuling@sinopharm.com

引用本文：雷富植, 李秀玲. 柯萨奇病毒A组6型所致手足口病研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2021, 44(4): 229-234.  

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20201116-00111