《科学》：张峰团队揭示与自闭症风险基因相关的神经元和胶质异常

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所有的孩子都生活在同一片天空下，但不是所有的孩子脸上都洋溢着天真的笑容。有这么一群特殊的孩子，他们不聋，却对声音充耳不闻；他们不盲，却对周围人与物视而不见；他们不哑，却不知该如何开口说话。

他们，被称为“来自星星的孩子”。

儿童自闭症，是一类以严重孤独、缺乏情感反应、语言发育障碍、刻板重复动作等为特征的发育障碍疾病。患有自闭症的孩子在外表上与常人一般无二，但却像隔了一堵无形的墙，使人无法触及他们的内心。

更令人遗憾的是，目前治疗自闭症的方法十分有限，早发现、早治疗、早干预已经是当下较有效的治疗措施。

2020年11月27日，张锋、Paola Arlotta和Aviv Regev领导的研究团队在Science上发表了题为：《In vivo Perturb-Seq reveals neuronal and glial abnormalities associated with autism risk genes》的研究论文。

此项研究应用CRISPR基因编辑技术和单细胞测序技术的组合系统——Perturb-Seq，成功在多个小鼠胚胎中敲除35个自闭症谱系障碍(ASDs)候选基因。这种方法可以识别神经元和神经胶质细胞中的基因表达网络，以此揭示ASD相关基因的新功能。

CRISPR-Cas技术与单细胞RNA测序的联合

组织是复杂多样的，包含多种细胞类型。细胞内有成千上万的基因与人类疾病相关，而这些基因的破坏可能会影响组织中任何一个甚至所有的细胞。因此，即使CRISPR基因编辑技术已经十分发达，但想要研究哺乳动物组织中所有细胞类型的基因敲除影响仍是十分困难的事情。

Perturb-Seq通过与ASD/ND相关的危险基因的微扰确定了神经元和神经胶质相关的效应

单细胞RNA测序和CRISPR-Cas技术的结合为研究人员提供了新的思路，这一组合系统可以生成丰富的细胞信息描述（如转录组），同时引入和评估遗传扰动的影响。因为每个细胞都是独立测序的，所以可以创建具有不同遗传操作的嵌合组织，并在一次实验中评估多种基因对细胞类型和状态的影响。

Perturb-Seq对ASD/ND候选基因进行功能评估

在此项研究中，研究团队应用一种可扩展的遗传筛选方法——Perturb-Seq，实现对35个自闭症谱系障碍/神经发育迟缓(ASD/ND)候选基因进行功能评估。通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，研究人员在小鼠胚胎的大脑中引入这些风险基因的移码突变，然后对出生后小鼠的大脑中受干扰的细胞进行单细胞RNA测序。

体内Perturb-Seq平台的模式图

研究人员发现，在这35个ASD和ND相关基因中，有14个具有可检测的效果。这些数据强调了ASD和ND病理的复杂性，因为神经胶质细胞和神经元细胞都显示了紊乱的表达网络。

为了确定在小鼠大脑皮层中发现的扰动相关基因模块是否与ASD/ND病理相关，研究人员对ASD和控制人类大脑的数据进行了共分析。结果表明在小鼠Perturb-Seq分析中确定的几个基因在人类脑组织中都是保守的。与ASD患者的单细胞数据比较显示，两者在受影响的细胞类型和转录组表型上都有重叠。

Perturb-Seq检测ASD/ND风险基因的细胞型分析

例如，染色质域解旋酶DNA结合蛋白8 (Chd8)的干扰影响胶质细胞的表达模式，包括少突胶质细胞和星形胶质细胞。Chd8在小鼠皮层的兴奋性神经元中高度表达，先前的研究表明，Chd8的单倍体功能不全会影响皮层和纹状体中神经元网络的发育。

在Chd8+/−小鼠模型中验证少突胶质细胞的扰动作用

但值得注意的是，本研究表明Chd8扰动对兴奋性神经元无显著影响。由此可见，复杂的神经元和神经胶质相互作用可能导致与ASD和ND相关的多种多样的病理变化，并且可能在每个大脑区域都有特定的作用。

Perturb-Seq也不可避免地具有一定的局限性

整体来说，这项研究是成功的，这也使得我们对受特定自闭症谱系障碍风险相关基因影响的细胞类型有了更多的了解。然而，Perturb-Seq分析也具有一定的局限性。

例如，使用Perturb-Seq，很难确定该基因是否与某个病例有关。此外，与经典的体内遗传筛选相比，Perturb-Seq的基因缺失的表型效应并不明显。更重要的是，单细胞基因组扰动测序需要层层过滤、计算分析和统计测试来评估表型效应。并且当对于任何给定的干扰每个细胞类型的数量很少时，基因缺失细胞和正常细胞之间的简单差异表达分析是不能被执行的。

体内Perturb-Seq揭示了ASD/ND风险基因微扰的细胞类型特异性效应

除此之外，相对于接受对照组的细胞，微扰效应大小是根据不同细胞类型的相关表达模块计算的。数据稀疏、批次之间的技术差异、遗传消融状态的不确定性和某些细胞类型的低细胞数量，使得使用单细胞RNA测序数据很难正确评估扰动相关表型。

在本研究中，作者通过在单基因缺失的小鼠以及自闭症患者的脑组织中进行后续实验，验证了某些关键关联。数据指向了患有ASD/ND的人类和小鼠的一组基因，这些基因一直处于失调状态。

总而言之，此项研究表明结合CRISPR基因编辑技术和单细胞RNA测序技术开发的Perturb-Seq，是一种十分强大且应用灵活性好的新工具。它可以实现对一系列基因的功能评估测定，揭示这些基因在复杂组织中、单细胞分辨时的细胞内在功能。正如在这项研究中，研究团队演示了Perturb-Seq在小鼠发育中的大脑中的ASD/ND风险基因的应用。

值得一提的是，科学技术的发展使得科学家能够不断开发新的方法去做出更有创造性的研究。了解和开发ASD乃至所有其他人类疾病的治疗方法是迫切需要的，而如今，Perturb-Seq技术为我们打开了一扇全新的大门！

参考文献：

[1] Jin, Xin et al. “In vivo Perturb-Seq reveals neuronal and glial abnormalities associated with autism risk genes.” Science (New York, N.Y.) vol. 370,6520 (2020): eaaz6063. doi:10.1126/science.aaz6063

[2] Treutlein, Barbara, and J Gray Camp. “Sequencing perturbed cortex development.” Science (New York, N.Y.) vol. 370,6520 (2020): 1038-1039. doi:10.1126/science.abf3661