ADC药物研究中微流LC与纳流喷雾技术的突破

在过去的几年里，将天然(非变性)液相色谱方法与质谱结合起来研究蛋白质药物产品的电荷和结构异质性等变得越来越流行。尽管有各种各样的LC-MS方法，但仍然缺乏一个能够适应不同应用的集成平台。

近日，Regeneron公司在Journal of the American Society for Mass Spectrometry 杂志上发表了一篇文章，通过采用Newomics M3多通道喷针搭建了一个能够匹配高LC流速（0.1-0.8mL/min），可同时拥有纳喷喷雾效果的LC-MS通用，灵敏和稳定的平台用于ADC药物的分析检测。

该研究采用的Newomics M3为8通道的喷针设计，与淋浴头的水流类似，分成多通道以后，出来的水流细密，类比到离子源的环境中，小液滴的离子化效率变高，因此会提高灵敏度以及稳定性。同时该喷针还做成U盘式设计，安装上即插即用，与质谱的连接非常方便。

该文章的亮点在于：

创新的采用柱后分离策略，提高原有方法灵敏度。

从最前面的方法图可以看出：

• 色谱柱以及之前的方法还是分析规模，通过采用柱后分离策略，将色谱柱出来后的液流流速降低至M3的适用范围（<10 uL/min），实现了更为柔和的电离，并且提高了方法灵敏度和对高盐浓度的耐受性。
• 该流速从分析流速到微升流速的下降是通过不锈钢三通实现的，将大部分液流分流至另一流路进行UV分析。

研究者在该方法体系下测试了

（1）前端LC可为SEC/IEX/HIC，其方法具有普适性；

（2）0.1-0.8mL/min流速在该平台上的耐受性；

（3）600mM以下的乙酸铵浓度体系耐受性，若对进质谱盐浓度要求有限制，可加一路溶剂水来稀释流动相；

（4）同时，该方法体系能够轻松实现电荷数更低的Native MS结果，更有助于分析目标物的异质性。

在这个体系下ADC药物DAR比率的检测结果如何？

半胱氨酸连接的抗体-药物偶联物（ADC）由于缺乏链间二硫键而在气相中不稳定，以及不同数目的环糊精引起的高质量异质性有效载荷，常常对完整的蛋白质分析提出挑战。通过使用SigmaMab ADC Mimic作为模型系统，研究者评估了在线减少电荷对Cys连接的ADC的MS分析的优势。

由于不同数量的有效载荷引起的质量异质性增加，在不减少电荷的情况下进行分析时，不同DAR（药物与抗体的比率）物种的电荷状态包络在某些m / z区域重叠。

• 例如，来自DAR8的+ 30，+ 29和+28电荷状态分别出现在与来自DAR0的+ 29，+ 28和+27电荷状态相似的m / z区域中（图b，下图）。
• 重叠的m / z区域可能会导致频谱解卷积困难，在这种情况下，解卷积后未检测到DAR0种类（图c，底部）。
• 相比之下，利用ACN / NH 3辅助的电荷减少，整个电荷状态移动到较高的m / z区域，相邻电荷状态之间的空间分辨率大大提高。

• 在不降低电荷的情况下进行分析时，即使施加了最小的源内能量（SID = 50 eV），也很容易观察到非共价ADC复合物的解离，从而导致形成了高电荷轻链（LC）物种和带电荷的H2L物质（图a，底部）
• 相反，当应用ACN / NH 3辅助电荷减少时，即使施加了更高的源内能量（SID = 100 eV，已针对有效去溶剂化进行了优化；图b，上图），这种解离事件也被显著减少。
• 相对于完整的ADC，随着电荷减少，这种解离倾向估计将从8.3％降低至0.4％。

当然，M3多通道喷针带来的稳健性Robustness也是相当优异的。连续多针的样品进样，其CV值控制在10%以下。

更多Newomics M3喷针介绍请看视频：

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