核酸药是现今药物研发的热点领域之一，在传染性疾病、肿瘤、慢性病等方面不断取得进展。在核酸药物的众多类型中，小核酸药物由于具有靶点丰富、研发周期短、药效持久等特点，临床优势日益凸显。2021年，全球小核酸药物市场规模达到32.5亿美金，过去四年行业复合增长率达到33%，预计2024年将达到86亿美金。小核酸药物开发过程中有三个关键环节，分别是序列设计、合成与修饰以及递送系统，而该市场未来几年主要增长驱动力正是来自于全新递送技术的突破。Biacore作为药物研发中不可或缺的互作技术，已经广泛应用于小分子药物及抗体的研究，对于小核酸药物递送壁垒的突破又能提供哪些助力呢？接下来我们从siRNA药物的靶向递送和PNA的研发当中一起寻找答案吧。
siRNA药物作为小核酸药中最常见的一种，凭借其高效的基因沉默效率､可控的不良反应以及合成方便等优点，成为核酸药物研发的一大热点。但是siRNA的体内递送一直是研发的难点，如何将siRNA高效、安全地递送到靶组织一直是siRNA临床转化面临的挑战。近年来已经出现多种成熟的递送方式，例如脂质纳米颗粒(LNP)递送，乙酰半乳糖胺(GalNAc)递送等等。在此基础之上，核酸药物的研发人员也一直在进行技术创新，尝试新的siRNA递送方式。
2022年日本 Kyowa Kirin公司报道了一种化学修饰的甘露糖配体递送模式（CMM4-siRNA），该模式靶向巨噬细胞（macrophages）和树突状细胞（dendritic cells）上一种内吞性的甘露糖受体CD206，将siRNA药物递送至巨噬细胞/DCs表面，通过CD206介导的内吞作用使siRNA进入细胞，从而沉默靶基因（图1）。
但是，天然甘露糖与CD206的亲和力较弱，因此在研发早期研究人员选用Biacore对化学合成的甘露糖进行了筛选和优化。对于合成的一系列甘露糖单体（4a-4f），基于Biacore设计的竞争抑制实验，评估其结合活性。如图2A所示，实验中将生物素化的天然甘露糖固定到SA芯片上，在固定浓度的CD206中预混不同浓度的待测样品（4a-4f），得到图2B的竞争抑制曲线。从图2C的表格中可以看出，4a和4f的竞争抑制能力最强，IC50分别达到＜0.160μmol/L和0.735μmol/L，抑制活性比α-甲基-甘露糖高出至少1000倍。
图2，Biacore竞争抑制实验筛选高结合活性的甘露糖单体
在Biacore实验结论的基础上，研究人员最终选择结合活性最强的4a经过进一步修饰得到了与siRNA的四价甘露糖偶联物CMM4-siRNA。用Biacore对CMM4-siRNA与CD206的亲和力进行了精确表征，将CD206通过anti-his抗体捕获到芯片表面（图3A），CMM4-siRNA作为分析物检测，结果表明两者的亲和力达到了2.9nM（图3B）。为了进一步确认CMM4-siRNA结合的特异性，研究人员评估了CMM4-siRNA与一系列糖结合受体的结合活性。结果表明不管是其他的甘露糖识别受体CD209，还是非甘露糖结合受体ASGPR，抑或甘露糖结合凝集素CD205，都与CMM4-siRNA没有结合或者具有明显更低的结合活性（图3C）。这一结果确认了CMM4-siRNA偶联物的结合特异性和强结合能力。
图3，Biacore检测CMM4-siRNA与CD206的亲和力及其他糖结合受体的结合特异性
在后续的细胞及动物实验中，CMM4-siRNA在表达CD206的细胞中也表现出了强大且持续的基因沉默能力，有效下调目标蛋白的表达量。这种化学合成修饰的甘露糖偶联的siRNA药物极大地拓展了siRNA的应用领域，也为今后siRNA药物的靶向递送提供了创新的理论基础。
说到靶向递送，以抗体偶联修饰siRNA（antibody-siRNA conjugates, ARC）的递送方法也是特异性递送的热点领域。2020年小核酸药物领域三巨头之一的Alnylam公司与美国Scripps研究所发表文章，介绍了一种基于双可变区（dual variable domain，DVD）抗体的ARC平台，能够高效地得到ARC偶联物，并且不会影响抗体与靶点的亲和力。
文章中采用Biacore评估偶联是否会影响抗体与靶点的亲和力，从图4的定量数据中可以清晰地看到，不管是siRNA4还是siRNA5的抗体偶联物，都不会影响与BCMA靶点的结合。
图4，Biacore检测抗体及抗体偶联物与BCMA的结合
肽核酸（PNA, peptide nucleic acid）是一种新型高效的microRNA抑制剂，以多肽骨架取代戊糖磷酸主链的DNA类似物。由于PNA不带负电荷，与核酸结合的稳定性和特异性都大为提高，具有广阔的应用前景。
2022年，科罗拉多大学和Sachi Bioworks公司共同发表的一篇文章中，报道了一种靶向新冠miRNA的PNA抑制剂SBCoV207，能够特异性结合miR-2392，在动物实验中表现出高度有效性和安全性（图5）。
图5，PNA通过靶向结合miR-2392发挥治疗新冠的作用
如何证明SBCoV207能特异性识别miR-2392呢？
研究人员在Biacore上设计了互作实验：
将生物素化的miR-2392固定在SA芯片表面，SBCoV207作为分析物进样（图6A），得到两者之间的亲和力为48.11nM，结合速率ka=1372M
-1
s
-1
，解离速率kd= 6.56 × 10
5
s
-1
，这种慢解离正是PNA与目的核酸结合的特征之一。
从对照实验可以看出（图6B），错义核酸对照（Missense）与miR-2392几乎没有响应信号，可以排除非特异结合对该实验的影响，说明Biacore实验结果的可信度。
Biacore上得到的定量数据在体外证明了SBCoV207与目的核酸片段miR-2392具有高亲和力，特别是具有慢解离的特性，能够和目的核酸互补稳定结合。
图6，Biacore检测SBCoV207/Missense与目的核酸的结合以及使用的核酸序列
Biacore作为唯一收录于中美日三国药典的分子互作金标准，在小核酸药物的研发中同样具有多重应用。除了能够提供精准的定量数据之外，还可以设计抑制实验得到更多的竞争数据，高灵敏度和分辨率能够准确区分不同样品亲和力的差异。对于核酸类的样品，Biacore提供了多种解决方案，除了能够将核酸作为分析物检测之外，SA/NA/CAP芯片可以实现核酸的可逆/不可逆捕获，方便不同研发目的的实验设计。
核酸药物被认为是继小分子药物、抗体之后的现代新药第三次浪潮，虽然在研发过程中还存在着诸多挑战，但是相信在Biacore的助力下，小核酸药物的应用领域和技术领域将不断突破创新，在未来将有更广阔的发展。
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4.行业分析数据来源：SWS Research: 小核酸药物行业分析
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