Mol Cell | 张锋等揭示Tn7转座系统靶位点选择因子的模块化和多样化

撰文 | 木兰之枻

Tn7是原核生物中广泛存在的DNA转座子，其经典的转座机制主要依赖于两种靶位点选择因子TnsD和TnsE，其中TnsD是序列特异性的DNA结合蛋白，可介导染色体靶位点的定向转座；TnsE则是结构特异性的DNA结合蛋白，可介导质粒复制叉附近的定向转座。近年来研究者还发现了一大类Tn7与CRISPR-Cas相结合的转座系统 （简称为Tn7-like CAST系统） ，它们可在向导RNA （crRNA） 的引导下实现定向转座，并可被改造用于大片段DNA在细菌基因组中的定向整合（专家点评Science+Nature长文| 当CRISPR遇上转座子——实现位点特异性DNA片段的高效、特异插入） 【1,2】 。之后研究者还探索了Tn7-like CAST转座系统的结构基础（Mol Cell | 畅磊福团队报道CRISPR-Cas12k在Tn7-like转座系统中的底物识别机理） 【3-4】 和crRNA的特征及功能（Cell | Tn7-CRISPR-Cas转座系统向导RNA的功能特化） 【5】 。随着研究的深入，研究者发现Tn7-like CAST系统具有多样化的转座机制：其中V-K型CAST系统依赖于crRNA，而I-B型CAST系统则依赖于TnsD蛋白实现定向转座（Cell | 张锋团队发现CRISPR相关转座系统归巢的两种机制） 【6】 。综上可知，Tn7相关转座系统的靶位点选择模式非常灵活，可借助非常多样化的靶位点选择因子实现快速转座，但这也导致靶位点选择因子的系统性研究难以开展。

2023年6月1日，来自美国HHMI和Broad研究所的Feng Zhang实验室与美国国家生物技术信息中心NCBI的Eugene V. Koonin实验室合作，在Molecular Cell发表题为 Modularity and diversity of target selectors in Tn7 transposons 的论文。文章 通过数据挖掘和结构分析对Tn7转座系统的靶位点选择因子进行了系统性分析，揭示了Tn7靶位点选择因子的模块化和多样化特征。研究还对多种新发现的转座系统如I-D型Tn7-like CAST系统、Tn6022-like转座子以及非Tn7转座子Tsy进行了深入探索和实验验证，极大的拓展了我们对转座系统靶位点选择机制的认识。

虽然Tn7转座系统的靶位点选择因子具有多样化特征，但这类因子均需借助TnsC来完成靶位点选择和转座。为此研究者选择TnsC蛋白进行基因组进化树分析并挖掘出了超8万种Tn7-like位点，随后借助系统进化树分析筛选出6348种具有代表性的TnsC同源蛋白进行后续研究。为探索靶位点选择因子的多样性，研究者对已知因子在系统进化树上的分布进行了定位，发现tnsD-tniQ的分布具有普遍性，而tnsE则局限于细菌来源的经典Tn7转座子和亲缘关系较远的Tn6022转座子。CAST系统中，I-B型和I-F型CAST均可细分为两种亚类，其中一类I-F型CAST拥有tnsD-tniQ并借助TnsD实现定向转座，另一类则借助crRNA实现定向转座。

分析过程中研究者发现了一种独特的I-D型CAST系统并对其中有代表性的CyCAST进行实验验证。结果显示CyCAST能编码结构和功能均完整的I-D型CRISPR-Cas系统，这提示I-D型CAST系统中CRISPR组分被Tn7 转座子劫持的时间并不久远。研究还发现，CyCAST具有与I-D型CRISPR系统相同的PAM识别序列为GTT，其在质粒上的定向转座具有单向性特点且整合位点主要位于原间隔序列下游70-80bp左右的窗口区。此外，CyCAST系统具有两种转座模式：既可借助TniQ在RNA引导下进行转座，还能借助TnsD实现蛋白依赖的定向转座。

很多Tn7都拥有tniQ-tnsD双基因，其中TniQ参与RNA引导的转座而TnsD参与蛋白依赖的定向转座，为此研究者对TniQ和TnsD在不同转座系统中的功能进行了分析。AlphaFold 2结构预测指出，不同转座系统来源的TniQ和TnsD蛋白在核心区存在非常明显的差异。以TniQ为例，Tn6677家族I-F型CAST系统的TniQ能通过Hel2结构域结合Cas6/7和向导RNA，而V-K型CAST系统的TniQ并无Hel2结构域，因此很可能拥有不同的转座机制。与TniQ相比，TnsD蛋白的C末端结构具有独特性，是转座系统识别靶位点完成转座的关键因子。

考虑到TniQ与Cas效应因子结合的多样性特征，研究者推测TniQ很可能具备结合其它类型靶位点选择因子的能力。随后的数据挖掘和分析指出，除了同时表达TniQ-TnsD双蛋白的Tn7转座系统外，还有大量Tn7-like转座系统同时表达的是TniQ和另一种靶位点选择因子如TnsE，结构预测提示TnsE很可能会特异性靶向质粒的复制叉实现定向转座。之后研究者还在Tn6022家族的Tn7-like转座系统中发现了另一种独特的靶位点选择因子TnsF。后续的验证实验发现，代表性的AjTn6022转座系统中，TnsF能特异性结合AjTniQ并深度参与转座过程。

最后，研究者在对TnsF同源蛋白进行数据挖掘时发现了一类TnsF-like转座系统Tsy，这类转座系统的基因组邻近位点并无Tn7组分，是一类非Tn7型转座系统。在对代表性的ZooTsy进行实验验证后研究者发现其核心组分包括TnsF、酪氨酸重组酶YRec、小型的HTH结构蛋白以及GIY-YIG核酸酶，其转座过程主要依赖于TnsF、YRec和HTH。研究证实TnsF是一类酪氨酸重组酶家族相关的靶位点选择因子，并参与了至少Tn6022和Tsy两类转座系统的靶位点选择和定向转座。

总体而言，本研究通过数据挖掘、结构分析和实验验证，对Tn7转座系统的靶位点选择机制进行了系统性的探索和总结。在此过程中研究者发现了多种新型的靶位点选择因子，还发现了一种独特的转座子家族。这一研究让我们对Tn7转座系统在靶位点选择方面的模块化特征和多样化因子有了更全面更深入的了解和认识。

原文链接

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.05.013

制版人：十一

参考文献

1. Klompe, S. E., Vo, P. L. H., Halpin-Healy, T. S. & Sternberg, S. H. Transposon-encoded CRISPR–Cas systems direct RNA-guided DNA integration. Nature 571, 219–225 (2019)
2. Strecker, J. et al. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science 365, 48–53 (2019)

3. Halpin-Healy, T. S., Klompe, S. E., Sternberg, S. H. & Fernandez, I. S. Structural basis of DNA targeting by a transposon-encoded CRISPR–Cas system. Nature 577, 271–274 (2020).

4. Xiao, Renjian et al. Structural basis of target DNA recognition by CRISPR-Cas12k for RNA-guided DNA transposition. Molecular Cell, Volume 81, Issue 21, 4457 - 4466.e5

5. Petassi, M.T., Hsieh, S.C., and Peters, J.E. (2020). Guide RNA categorization enables target site choice in Tn7-CRISPR-Cas transposons. Cell 183, 1757–1771.e18.

6. Saito, M. et al. Dual modes of CRISPR-associated transposon homing. Cell 184, 2441–2453.e2418 (2021)

‍

转载须知

【原创文章】BioArt原创文章，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，所刊登的所有作品的著作权均为BioArt所拥有。BioArt保留所有法定权利，违者必究。