Cell Stem Cell | 高通量体外类器官平台助力多囊肾病新药研发

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关键词：新药Cell药研发药研发器官

资讯来源：BioArt

发布时间： 2022-08-01

撰文 | 觉主在路上

常染色体显性多囊肾病（Autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD）是最常见的遗传性肾病，约93%病人具有PKD1或PKD2基因突变【1】，临床表现为双侧肾囊肿进行性扩大，导致肾功能衰退和其他脏器并发症，进而威胁生命。目前临床上主要治疗手段为肾移植， FDA 批准的唯一一种针对ADPKD 的药物托伐普坦，仅适用于特定肾细胞囊肿病人群体减缓病程发展，并没有广谱有效的治疗药物【2】。近年来，体外类器官培养系统因其具有与人类器官具有高度相似性而被广泛应用于新药研发，针对多囊肾病类器官模型系统的研发也在如火如荼的进行，但因其与疾病相似度低、培养体系不稳定和低通量等问题而无法有效的应用于药物研发 【3-5】。

为了加快针对ADPKD新疗法的探索，2022年7月7日，来自美国南加州大学（USC）干细胞生物学和再生医学教授Andrew P. McMahon实验室在Cell Stem Cell上发表了文章A scalable organoid model of human autosomal dominant polycystic kidney disease for disease mechanism and drug discovery，通过诱导多功能干细胞，利用单细胞测序等实验手段，获得大量培养稳定、和人肾单位结构高度相似的肾类器官，并进一步使用基因编辑手段，获得高仿生ADPKD体外培养疾病类器官，通过使用商业化小分子库进行了药物筛选PoC验证，发现了能够有效抑制囊肿形成的小分子抑制剂。该系统具有低成本、高通量和可重复性等特性，为ADPKD有效治疗药物筛选提供了可能。

研究人员首先建立可重复稳定使用、模拟肾单位结构功能的类器官培养系统。将MAFB-P2A-eGFP H9 hESC细胞在EZSPHERE的12孔板内进行培养，在不同时间点通过调节细胞铺板密度和信号通路的变化进行增殖和分化 (图1) ，并对肾单位发育过程中不同阶段标志物进行染色和单细胞测序后发现，这种方法能够稳定培养出大量类肾单位结构（nephron-like structures）的类器官。接下来，为了验证这些肾类器官同样具有肾功能，研究人员将体外培养的类器官移植到小鼠肾内，通过进行标志物荧光染色和渗透实验证明，这些类器官确实能够增加小鼠肾脏血管化并影响肾过滤功能。

图1 Schematic diagram of directed differentiation to generate kidney organoids

接下来，在稳定肾类器官培养的基础上，研究人员尝试建立ADPKD疾病类器官模型。通过CRISPR-Cas9技术敲除PKD1或者PKD2基因，对获得的PKD1^-/-和PKD2^-/- 进行表型分析发现，敲除的类器官在诱导分化后第15天开始长出和野生型类器官不一样的突起（红色箭头），这种突起如同充水的气球一般，为囊肿状（cyst, 绿色箭头），和疾病病理组织类似。同时，研究人员发现一个有趣的现象，这种囊肿的形成和铺板密度相关，随着密度的增加，囊肿的形成会减少且时间相对滞后。

最后，研究人员利用上述疾病类器官模型进行小分子抑制剂筛选。对囊肿生成阶段（cyst initiation）的敲除类器官进行化合物单点和梯度剂量处理，接下来每天对每个类器官形态进行为期6天的自动拍照记录，最后对具有囊肿的类器官数量进行统计，定义在不影响类器官生长状态的情况下有效抑制囊肿的生成的抑制剂为阳性分子（positive hit）。最终结果显示，quinazoline (QNZ) 能够在多种剂量、两种敲除（PKD1^-/-和PKD2^-/-）类型的类器官模型上有效抑制囊肿生成 （图3），半抑制剂量在nM级别，此外，QNZ在囊肿生成后早期类器官和后期类器官上也能够有效降低囊肿大小而没有引起明显的细胞凋亡，因此，研究人员认为，QNZ可能是一个针对ADPKD疾病具有特异性和有效性的抑制剂原型，但是，这个结论基于本研究所有的体外实验结果，需要后续更多的体内实验证据支持。

总的来说，本研究建立了一个稳定、高通量、类肾单位结构功能的肾类器官培养体系，基于这个体系，构建了模拟ADPKD疾病的类器官模型，利用这个模型，进行了早期药物筛选的概念验证，为肾疾病的机制研究和新药研发提供了有力的支持。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.stem.2022.06.005

制版人：十一

参考文献

1. Harris, P.C., and Torres, V.E. (2018). Polycystic kidney disease, autosomal dominant. In GeneReviews, M.P. Adam, H.H. Ardinger, R.A. Pagon, S.E. Wallace, L.J.H. Bean, K.W. Gripp, G.M. Mirzaa, and A. Amemiya, eds. (University of Washington).

2. Ransick, A., Lindstro¨ m, N.O., Liu, J., Zhu, Q., Guo, J.J., Alvarado, G.F., Kim, A.D., Black, H.G., Kim, J., and McMahon, A.P. (2019). Single-cell profiling reveals sex, lineage, and regional diversity in the mouse kidney. Dev. Cell 51,399–413.e7.

3. Cruz, N.M., Song, X., Czerniecki, S.M., Gulieva, R.E., Churchill, A.J., Kim, Y.K.,Winston, K., Tran, L.M., Diaz, M.A., Fu, H., et al. (2017). Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nat. Mater. 16, 1112–1119.

4. Kumar, S.V., Er, P.X., Lawlor, K.T., Motazedian, A., Scurr, M., Ghobrial, I., Combes, A.N., Zappia, L., Oshlack, A., Stanley, E.G., et al. (2019). Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development 146. dev172361.

5. Booij, T.H., Leonhard, W.N., Bange, H., Yan, K., Fokkelman, M., Plugge, A.J., Veraar, K.A.M., Dauwerse, J.G., van Westen, G.J.P., van de Water, B., et al.(2020). In vitro 3D phenotypic drug screen identifies celastrol as an effective in vivo inhibitor of polycystic kidney disease. J. Mol. Cell Biol. 12, 644–653.

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