NBE | 体内单碱基编辑应用新进展：刘如谦开发单一AAV递送的小型化ABEs

撰文 | 木兰之枻

CRISPR-Cas系统已经成为基因编辑研究的利器，由此衍生而来的精准编辑系统—单碱基编辑器能有效实现C-T编辑 （CBE系统） 和A-G编辑 （ABE系统） ，其临床应用的潜力和价值广受关注 【1,2】 。目前CRISPR-Cas及衍生的单碱基编辑器应用的最大阻碍之一是“体型”过大，难以通过单一的AAV系统进行有效递送，这极大的限制了其临床应用前景。不过研究者已发现多种体型较小的Cas9系统如SaCas9、SauriCas9、CjCas9和Nme2Cas9 （~1000氨基酸） ，以此为基础衍生的单碱基编辑器或能突破体型限制，从而进一步推动单碱基编辑器的临床应用。

2022年7月28日，来自美国哈佛大学David Liu实验室在Nature Biomedical Engineering发表题为 Efficient in vivo base editing via single adeno-associated viruses with size-optimized genomes encoding compact adenine base editors 的论文。文章 将小型Cas9与升级版TadA-8e脱氨酶融合，成功开发出可通过单一AAV有效递送的小型化ABEs。新系统在小鼠体内多种组织中均能实现高效的单碱基精准编辑，从而为基因治疗的临床应用提供了新利器。

文章伊始，研究者以SaCas9和TadA8e 【3】 为基础构建出SaABE8e （3.9kb） 和SaKKH-ABE8e （SaKKH为SauriCas9的PAM变体） ，并进一步对启动子和终止子元件的组合进行优化筛选，以满足单一AAV病毒体内高效递送和精准编辑的需求。结果发现EFS-SaABE8e-bGH组合的体内编辑效果最佳。

研究者之后利用优选sgRNA （靶向小鼠Pcsk9基因） 与EFS-SaABE8e-bGH组合，并包装成单一AAV病毒进行体内单碱基编辑研究。研究者在6-8周龄小鼠中通过后眼窝注射AAV病毒并在三周后分析其编辑效率。结果显示，高剂量 （4x10¹¹ vg） 和低剂量AAV （4x10¹⁰ vg） 递送的SaABE8e在肝脏中的编辑效率可达64%和55%，这与双AAV递送系统的效率接近。在心脏中高剂量和低剂量AAV递送的SaABE8e的编辑效率分别达到23%和13%，这要比双AAV递送系统的效率分别高1.4和4.8倍。研究还指出，将AAV病毒剂量提升至8x10¹¹ vg （与双AAV系统的最高剂量相同） ，小鼠心脏和肌肉组织中的编辑效率也大幅提升至33%和22%，这比双AAV递送系统的效率分别高2.1和2.5倍。

考虑到SaCas9受PAM序列的限制较大 （PAM为NNGRRT，突变体SaKKH的PAM为N₃RRT） ，研究者进一步将脱氨酶TadA-8e与其它小型化Cas9如Nme2Cas9 （PAM为N₄CC） 、CjCas9 （PAM为N₃VRYAC） 及SauriCas9 （PAM为N₂GG） 组合，构建出一系列适用于单一AAV递送的小型化ABEs。HEK293T细胞实验证实，新构建的小型化ABEs具有很高的单碱基编辑效率 （40%~70%） 和更大的活性窗口。此外， 新构建的一系列小型化ABEs可对人类基因组中约82%的腺嘌呤（A）进行有效编辑，这表明小型化ABEs具有非常广阔的应用潜力。

为进一步验证小型化ABEs用于体内治疗的潜力，研究者选择PCSK9基因人源化的小鼠和普通小鼠，以人源化PCSK9基因、小鼠源Pcsk9和Angptl3基因为靶点进行单碱基编辑以探索其降低血脂的能力。研究者首先在HEK293T细胞内筛选出优选sgRNA和小型化ABEs的组合，并在此基础上完成单一AAV病毒的包装以开展体内功能研究。通过后眼窝注射AAV病毒四周后，研究者发现SaKKH-ABE8e、相关突变体以及SauriABE8e对小鼠模型中人源PCSK9、小鼠源Pcsk9和Angptl3的平均敲除效率均超过40%，且最高可达61%。研究还指出，单一AAV系统递送的小型化ABEs在单碱基编辑效率方面可媲美双AAV系统递送的传统ABEs；而且在低病毒剂量时，单一AAV系统递送的小型化ABEs具有更高的编辑效率。

证实了单一AAV递送小型化ABEs可实现靶基因的高效编辑后，研究者对靶基因编码的蛋白表达水平进行了分析，发现循环系统中的PCSK9、Pcsk9和Angptl3蛋白水平降低了90%以上。 已知PCSK9和ANGPTL3基因敲除可降低血脂含量，进而降低心血管疾病的发病风险，因此研究者对小鼠的血脂含量也进行了分析。结果显示，PCSK9人源化的小鼠经处理后，血液中的总胆固醇下降了24%；普通小鼠中编辑Pcsk9和Angptl3后，血液中的总胆固醇分别下降了25%和38%。研究还指出，循环系统Pcsk9和总胆固醇含量的降低与AAV用量之间存在剂量效应，并且与基因编辑效率密切相关。由于Angptl3基因敲除会影响甘油三酯含量，研究者最后还对Angptl3为靶基因的小鼠体内甘油三酯含量进行分析，发现单一AAV递送的小型化ABEs处理后，循环系统甘油三酯的含量降低了45%。最后研究者还对单一AAV递送小型化ABEs在DNA和RNA水平的脱靶效应进行了分析，发现其在小鼠体内的DNA和RNA脱靶风险均处在较低水平，并且可通过脱氨基酶突变进一步降低。

总体而言，研究者通过将小型Cas9与优化的脱氨基酶TadA-8e融合，获得了一系列可通过单一AAV有效递送的小型化ABEs。新开发的小型化ABEs可覆盖人类基因组中约82%的腺嘌呤（A）位点，并在小鼠模型中通过靶向PCSK9和Angptl3有效降低了血脂水平，为小型化ABEs的未来应用奠定了基础。此外，与已有研究相比，本文在多种组织中的单碱基编辑效率均创下了临床剂量下的新高，这为未来的临床应用提供了新的参考。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41551-022-00911-4

制版人：十一

参考文献

1. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420–424 (2016)..

2. Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464–471 (2017).

3. Richter, M. F. et al. Phage-assisted evolution of an adenine base editor with improved Cas domain compatibility and activity. Nat. Biotechnol. 38, 883–891 (2020).

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