BPIT 展会预告丨从研发到中试/生产：细胞培养工艺如何有效地进行放大

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关键词：细胞研发

资讯来源：医麦客

发布时间： 2021-04-07

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2021年4月7日/医麦客新闻 eMedClub News/-随着抗体药物领域的高速发展，动物细胞培养工艺也在不断的更新和优化，培养规模更是从早期的百升级别扩大到万升级别。抗体药物的生产工艺如果从细胞复苏开始计算，细胞不断培养和扩增阶段占据了整个流程的大部分时间。因此，细胞培养工艺的优劣是抗体生产中最关键的因素之一。

抗体药物通过QbD的方法进行生产上游工艺的开发，利用实验设计（DoE）和高通量平行生物反应器等技术、设备的优势，高效的完成抗体实验室规模的研发工艺，尽早了解产品关键质量属性（CQAs）和关键工艺参数（CPP）之间的关系，以及确定研发工艺中的设计空间（Design Space）。一旦完成这些小规模研发工艺后，接下来就需要进行工艺的放大。理想情况下，高效的工艺放大能在2-4个月内完成从研发规模到中试/生产规模的过渡。如何实现高效的工艺转移和放大，是对整个工艺技术团队经验和水平严峻的考验。

工艺放大的目标是在细胞培养规模逐渐扩大的情况下，保证细胞在相对恒定的环境中稳定的生长以进行产物的表达。衡量的标准包括细胞密度、生长速率、活率、产物表达率和糖基化水平等多方面。在细胞培养工艺的放大过程中关键控制参数会分为两种类型。一种是和体积无关的，例如温度、DO和pH等。另一种是受体积和几何尺寸影响的，例如搅拌速度和通气流量等。由于在研发阶段使用的罐体供应商多种多样，罐体的材质（一次性或玻璃）、高径比、搅拌桨直径和罐径比和放大后使用的罐体一般都不完全一致；甚至同一供应商不同体积的罐体也不能做到等比例尺寸放大。这就给放大后搅拌、通气等参数的确定带来很大的挑战。为保持培养环境的一致性，开发人员通常会采用以下几种放大准则。

恒定叶端速度（Tip Speed）

细胞培养工艺中，搅拌桨剪切力是需要考虑的重要因素之一。不同的工程细胞株对剪切力的耐受能力不同。早期CHO细胞耐受的剪切力较低，现阶段的工程细胞株对剪切力的耐受得到很大的提升。剪切力往往通过叶端速度来体现。搅拌桨直径和转速决定叶端速度的大小。由于罐体设计的需要，罐体体积的增加，搅拌桨直径也会增加。因此恒定叶端速度的模式下，大体积罐体的搅拌速度要低于小体积。恒定叶端速度的放大可以让细胞在同样的剪切力环境下生长。这种放大策略适用于小规模的放大和生产。

恒定混匀时间（Mixing time）

混匀时间是比较简单的一个放大准则。尤其在化工行业，混匀时间的恒定可以直接作为放大的依据。但在细胞培养工艺中，小规模（如2L以下）体积可以很快达到混匀时间，而大体积则需要更高的叶端速度才能达到混匀时间。这就会导致剪切力的提高，造成细胞的损伤。

恒定K_La

K_La是表征氧气从气相进入到液相的速率。反应器中合适的K_La是工艺放大的关键，O₂作为细胞的重要营养物质，影响细胞的正常生长及代谢。恒定的K_La放大准则给细胞提供了相同的氧传递环境。但K_La的测定受很多因素影响。例如培养过程中搅拌速度、通气流量等，需要很多测试和分析来确定合适的K_La。在实际操作过程中，K_La随着工作体积的增加而增加。当达到一定体积后，K_LaCO₂又会和K_La相互影响，提高了K_La恒定放大难度。

▲ 不同叶端速度和气体流量下Eppendorf BLU 0.3L到50L的K_La

恒定单位体积功耗比（P/V）

P/V和搅拌功率（Np ，Power Number）、罐体直径、搅拌桨直径、工作体积、液体密度等很多因素有关，一定程度上体现了混合程度，影响培养体系的混合和传质。因此恒定P/V被推荐为很多工艺放大的准则，是当前最常采用的放大策略。考虑到细胞剪切力的耐受性不同，常见的P/V范围在10-40 W/m³。

▲ 影响P/V值的诸多因素

除以上4个放大依据外，放大到一定体积的规模时，还需要考虑pCO₂对细胞生长和蛋白表达的负面影响。小体积培养时，由于通入的气体在上升过程中可以带走大部分细胞代谢产生的CO₂，基本不用考虑CO₂去除（CO₂ Stripping）。而大体积培养中， K_LaCO₂随着反应器规模的扩大降低，即CO₂去除能力降低。体系中气体饱和度和气泡量直接影响CO₂去除，提高通气量及气泡停留时间可以加快移除。部分反应器供应商将CO₂去除功能整合进控制系统，方便对pCO₂的控制。

▲ Eppendorf BioFlo 720 气体控制界面（“CO₂↓”为CO₂去除功能）

无论哪一种放大策略，在使用过程中都会涉及搅拌速度、通气流量等在不同工作体积下的换算。这需要耗费开发人员大量的时间和精力。以Eppendorf BioFlo 720和320系列为代表的生物反应器控制系统，为减少工艺开发中恒定叶端速度和恒定P/V策略的参数换算，直接加入放大助手（Scale-up Assist）软件。该软件数据库包含了Eppendorf系列所有罐体体积，以及Thermo Fisher 50L到2000L的一次性罐体（S.U.B.，Single Use Bioreactor）的相关叶端速度、P/V值和对应搅拌、气体流量等的关系。同时也可以自定义输入其他供应商的参数，用于相互换算。这样的设计，减少了单一供应商或者多品牌供应商在罐体参数换算过程中的技术障碍，极大地简化了用户在Scale-up，甚至Scale-down开发中的工艺流程。