NSMB | 董浩浩/张兴/董长江合作阐述蛋白质机器 LolCDE 的功能和结构，系统揭示革兰氏阴性菌外膜脂蛋白的识别及转运机制

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目前具有多重耐药性的病原微生物或超级细菌的感染已给人类健康带来重大威胁。其中，革兰氏阴性菌（铜绿假单胞菌、肠杆菌、鲍曼不动杆菌）是临床常见，也是耐药菌最为集中的一类致病菌，其特有的外膜结构是防止抗生素进入细胞最重要的保护屏障。位于革兰氏阴性菌外膜的脂蛋白是一类重要的功能蛋白，参与众多外膜组分（包括脂多糖【1】、磷脂【2】、β-桶蛋白【3】和脂蛋白【4】等）的运输及组装，以维持细菌外膜脂质双分子层的不对称性、完整性及各项生理功能，是整个外膜形成的核心，对于耐药菌的生长和存活起到了重要的作用。脂蛋白定位机器 (localization of lipoprotein) LolCEDAB 负责将几十种外膜脂蛋白从细菌内膜转运到外膜。外膜脂蛋白在细胞内膜中的错误定位可导致细菌死亡，因此理解外膜脂蛋白定位机制，对于开发潜在新型抗生素具有重要意义。

 

2021年3月29日，四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室／国家老年疾病临床医学研究中心董浩浩研究员团队、浙江大学医学院冷冻电镜中心张兴教授团队和英国东安格利亚大学医学院董长江教授团队合作在Nature Structural & Molecular Biology上发表题为 “Structural basis for bacterial lipoprotein relocation by the transporter LolCDE” 的研究论文，首次解析脂蛋白定位机器LolCDE的结构，同时系统深入地研究了其识别与转运底物脂蛋白的具体机制，为以此蛋白机器复合物为靶点研发新型抗菌药物奠定了坚实的基础。

革兰氏阴性菌的脂蛋白（包括内膜脂蛋白和外膜脂蛋白）在细菌胞内合成后通过Sec途径整合到内膜中，接着经过一系列酶的加工修饰形成成熟的脂蛋白，随后蛋白质机器LolCDE通过识别脂蛋白N-端的转运信号来分类是否为外膜脂蛋白，从而将目标底物脂蛋白由内膜提取并转运给周质中的传递蛋白LolA。在这一过程中，脂蛋白的识别和转运尤为重要，近些年虽有一定研究报道，但其机制依然不十分清楚，特别是蛋白质机器LolCDE所发挥的具体作用，在分子层面缺乏完整的证据。

图1. LolCDEAB转运外膜脂蛋白图示及体外转运实验设计

 

为深入探索脂蛋白定位机器LolCDE发挥的具体机制，该研究团队通过单颗粒冷冻电镜技术首次解析了负责该步骤的LolCDE的分子结构，揭示了蛋白质复合体各功能域与配体之间的分子细节和相互作用关系。通过捕获处于不同转运阶段中LolCDE的不同功能构象，包括无底物态（apo-state）、底物结合态（lipoprotein-binding state）、ATP结合态（ATP-bound dimerized state）和与LolA相结合的底物释放前态（LolA-bound pre-release state）等6个高分辨率冷冻电镜结构，展示出一套完整的脂蛋白转运的机制动态变化过程。

该研究发现证实了LolCDE不同于其他细菌ABC转运体的对称变构机制，其两个跨膜亚基LolC和LolE在参与脂蛋白转运中具有不同的功能。LolE负责识别和定位脂蛋白，而LolC充当一个机械杠杆，传导ATP结合及水解前后NBD（ATP结合域 nucleotide-binding domains）到PD（周质域 periplasmic domains）的构象变化，通过协调蛋白质机器的各个功能域以进行脂蛋白的提取和转运。LolCDE与其他VII型ABC 转运体的结构同源性表明，该机械转导机制可能在此类转运蛋白家族中通用。不仅如此，该研究通过详尽分析蛋白质机器LolCDE与底物脂蛋白所结合的分子细节，开展了定点单突变和体外磷脂囊泡的模拟转运实验，发现了多个通过阻碍其转运功能可抑制细菌生长的功能位点，这些功能位点可作为研发抑制剂的药物靶点。

总之，该研究不但对于理解其它VII型ABC转运体的作用机制具有重要参考意义，而且对多重耐药革兰氏阴性菌治疗性药物开发具有十分重要的指导意义。

 

四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室副教授唐晓迪博士、浙江大学医学院冷冻电镜中心工程师常圣海博士、四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室实验助理人员张可及博士研究生罗庆华为该论文的共同第一作者。同时该研究得到了四川大学魏霞蔚教授、朱晓峰教授和武汉大学张郑宇研究员团队的大力支持。

 

原文链接：

https://dx.doi.org/10.1038/s41594-021-00573-x

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参考文献

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2.Tang, X. et al. Structural insights into outer membrane asymmetry maintenance in Gram-negative bacteria by MlaFEDB. Nat. Struct. Mol. Biol. 28, 81–91 (2021).

3.Gu, Y. et al. Structural basis of outer membrane protein insertion by the BAM complex. Nature 531, 64–69 (2016).

4.Takeda, K. et al. Crystal structures of bacterial lipoprotein localization factors, LolA and LolB. EMBO J. 22, 3199–3209 (2003).