干货+福利|抗体药物研发及生产关键技术一站式解决方案

自1997年FDA批准第一个治疗淋巴癌的嵌合单抗药物Rituxan, Anti-CD 20至今FDA批准的治疗性抗体药物，一半以上用于治疗癌症和自身免疫症。抗体药物是所有药物类别中增长最快的类别，2019年全球销售额达1500亿，30余个品种年销售额超过10亿美元成为“炸弹药物”。高利润下的追逐，使蛋白质组学、高通量筛选技术得到发展，同时，也给抗体研究带来更多机遇和挑战。

传统的抗体药物以单抗为主，近些年在单抗的基础上进行衍生出了创新型抗体药物（图1）：①抗体偶联药物，由三部分构成：抗体、小分子药物和连接臂。抗体可以特异性的靶向特定抗原，linker作为ADC药物的桥梁，毒素小分子应具有高毒性活性和低免疫的特征。生产工艺包括单抗生产、化学偶联和下游纯化。②双特异性抗体，含有两个特异性抗原结合位点或两个表位的抗体分子，改变了传统单抗的双价、单靶点的结构特点，实现阻断或激活多个信号通路，可以发挥两种单抗联合的协同作用。③Fc融合蛋白，功能蛋白分子与Fc片段融合而产生的新型重组蛋白，④抗体片段，可由完整的抗体经不同蛋白酶（eg. 胃蛋白酶和木瓜蛋白酶）切割后得到，也可通过基因工程得到，每一个都能有特异性的结合区和功能特质。

图 1  治疗性抗体分类

不论是传统的单抗还是近些年发展十分迅猛的新型抗体，都是是生物制药中复合增长率最高的一类药物，在全球范围内市场庞大且未来前景广阔。

生物药研发生产主要包括药物发现、临床前研究、临床试验和商业化生产等阶段（图2），生物药研发整个流程下来平均需要消耗9.5-15年的时间，其时间成本、人力物力的投入都是巨大的。在整个药物研发生产阶段，由于工艺技术不成熟、疗效不确定、安全性等因素导致的研发失败，成为创新药研发较高的行业门槛，并导致创新药极具有稀缺性。因此，各大供应商也提出一整套的抗体解决方案为破除技术壁垒，来帮助客户在药物领域加速创新、提高生产力。

图 2  抗体药物研发生产阶段

作为科学服务领域的世界领导者，赛默飞世尔科技凭借合规和创新的产品与服务，为全球传统制药及生物制药行业提供创新型的解决方案。它从研发到大规模商业化生产再到配套的分析以及验证，提供全方位的产品和服务，以引导更为高效的制药行业发展流程。（图3）

图 3  赛默飞抗体药物整体解决方案

1.抗体药物研发

目前人们已知的药物靶点相对于未知的药物靶点来说还只是冰山一角。随着现代生物学技术的发展和人类基因组计划的完成，出现了大量可供治疗干预的新型靶点，但并非所有靶点都能成为与疾病相关的有效靶点，因此对新型靶点进行筛选和验证便成为非常重要的工作。靶点确定之后通过物理化学、结构和功能等分析途径确定候选抗体药物的关键质量属性（CQA），以加速研发进程，减少风险。赛默飞提供了从靶点筛选、验证到抗体筛选、验证等的以创新科技支撑抗体药研发赋能方案。

表1 赛默飞研发赋能方案

2.抗体工艺开发和放大

在抗体药物的大规模生产过程中，作为上游工艺核心的细胞培养和发酵工艺，需要在早期选择最合适的蛋白质表达细胞系，优化培养基、补料以保证真核或原核细胞处于最佳的培养条件，以此增加生物制品的表达，降低生产成本。在下游工艺开发和生产过程中，主要是对生物反应器/发酵罐中收获的产物进行纯化。针对上游工艺的开发和放大，赛默飞提供了细胞系开发和培养基优化、大规模培养的一次性使用技术产品、收获和收集等上游服务。针对下游工艺涉及到的纯化过滤和存储过程，赛默飞提供了多种类型的POROS^TM层析填料和Capture Select ^TM亲和配体来解决下游生产中的纯化问题。（图4）

图 4  赛默飞上下游的产品支持

2.1 上下游工艺技术介绍

商业化的抗体生产过程分为上游细胞培养，收获澄清和下游蛋白纯化，大体积样品存储和分装，整个过程如下图所示（图5）。上游工艺专注于细胞扩增和细胞培养以生产优质产品，下游工艺专注于保证抗体纯度的基础上提升抗体纯化能力。

图 5  抗体生产过程

a)细胞株的开发

细胞株的开发经历如下的工作流程（图6），从转染到pool的筛选再到3-6个细胞株的确定大约需要4-6个月的时间。评选标准主要有：抗体表达量、抗体质量、基因拷贝数等。

图 6  细胞株的开发流程图

中国仓鼠卵巢细胞（CHO）是目前重组蛋白生产领域最具代表性的工程细胞，其具有高效扩增和高表达的特点，据统计，使用CHO细胞系作为表达载体开发的抗体药物超过60%。目前，CHO已驯化出多种商业化细胞系，包括CHO-K1、CHO-S（赛默飞）、CHOZNGS-/-等。赛默飞推出的Gibco^TM CHOFreedom细胞系开发试剂盒 (图7)，在cGMP条件下建库、用AOF的CHO-STM和DG44稳定宿主细胞系，从转染到单细胞克隆开发时间缩短至5个月，表达量提高至2-3 g/L，一次性商业许可覆盖多个产品。

图7 Gibco^TMCHO

b)细胞培养工艺

上游的细胞培养工作主要包括MCB vial，摇瓶培养、seedtrain阶段，最后到生产用生物反应器。以上工艺的锁定需要从培养基优化、培养模式的设计、培养环境的优化、培养过程设计等方面筛选确定（图8）。

图8  培养条件的工艺摸索

培养基优化可采用多种方法，如单组分滴定法、废培养基分析法和培养基混合法。由于培养基组分复杂，蛋白水解物批与批之间的变异性大，在很大程度上国内培养基长期依赖进口，国际上主要的细胞培养基品牌中其中就包括了Gibco^TM（赛默飞）Gibco^TM培养基（图9）用户遍及全球，全球排名前25位的生物制药公司有24家使用Gibco细胞培养产品,并且Gibco AGT专利技术使无血清培养基使用更方便。

图 9  Gibco^TM Media

治疗用抗体的表达一般采用大规模悬浮动物细胞培养，可以选择批式流加（fed-batch）或连续灌注(perfusion)的培养方式。目前国际上主流抗体药物的生产工艺为批式流加培养，反应器主要采用一次性反应器，一次性的反应器采用预先灭菌的无菌无热原细胞培养袋，即开即用，避免了反应器日常清洗、灭菌和验证等操作，尤其适用于早期临床阶段的研究，因此越来越受到青睐。主流的反应器以SUB（赛默飞）为代表。

Thermo Scientific^TMSUB.、Thermo Scientific^TM HyPerforma^TMDynaDrive SUB.（赛默飞）一次性生物反应器，由一次性反应容器和一次性反应袋两部分组成。具有专利技术的双Sparger通气系统：典型的MicroSparger和MacroSparger；可以提供更好的O₂的传递和CO₂的吹扫速率；无需在位清洗和灭菌，便于操作、低成本快速建立生物药物生产线。此外，具有世界领先的膜材质，完善的验证资料。SUB反应器进行抗体的生产已经成功放大到2000L甚至5000L的规模（图10）。

图 10  Thermo Scientific^TM SUB

微生物的生长环境是极其微妙的，需要控制其关键工艺参数（CPP）来使细胞从扩增阶段向蛋白表达阶段转变，例如控制通气策略和搅拌策略。SUM系列（图11），可确保其获得出众且可重复的混合结果。

图 11 Thermo Scientific^TM HyPerforma^TM一次性搅拌器 (S.U.M.)

c) 蛋白纯化

典型的下游工艺如图12所示，这是一个去粗取精的过程，首先经过亲和层析一步纯化达到较高的纯度，之后经历2-3步的精纯层析去除微量杂质达到法规要求，越到后面中间品的价值也越高。

图 12  下游纯化过程

目前，约70-80%的抗体纯化使用ProteinA亲和层析，可以特异性的和样品中的抗体分子结合，而使其他杂蛋白流穿，具有极高的选择性，一步亲和层析就可达到超过95%的纯度。根据填料基架来划分，市面上主要有三类：玻璃基（Millipore），琼脂糖基 (GE Healthcare)，有机聚合物的树脂（赛默飞）。

图 13  CaptureSelect

亲和色谱后主要可采用阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、疏水作用色谱等方法去除宿主细胞蛋白质、高分子聚合物、DNA、内毒素和脱落的ProteinA配基等杂质。CEX主要采用吸附一洗脱模式，由于DNA、宿主细胞蛋白质、脱落的ProteinA配基和内毒素均带负电，与阳离子介质结合力弱而被除去，而目标抗体被保留，可通过改变pH洗脱下来。阳离子层析优化主要从三个方面：减少杂质的结合（达到70-80%杂质流穿），在较高电导率的基础上提高载量，较高的分辨率来去除杂质（酸性异构体，碱性异构体和聚体能够有较好的分离）。POROS CEX（赛默飞）树脂设计用于在一系列pH和电导率条件下实现高动态结合能力（图14），从而提高工艺开发的灵活性和生产通量。其粒径具备卓越的分离度（图15），不依赖规模和流速即可实现前所未有的杂质清除（图16）。这些50μm聚合物离子交换色谱树脂可用于生物分子（包括重组蛋白、单克隆抗体、DNA、病毒和肽类）的色谱分离。

图 14  POROS XS 在多种工艺下的高载量

图 15  POROS XS 分离度

图 16  随着线性流速增加，POROS XS 树脂保持着较高的分离度

AEX主要采用流穿模式，即杂质（DNA、endotoxin、virus）保留在柱上，而目标抗体穿过色谱柱，这需要目标抗体具有较高的等电点。阴离子层析优化主要从三个方面：增加杂质的结合力度，在较高电导率的基础上提高载量。

POROS AEX（赛默飞）该阴离子交换柱动态载量高、粒径50 μm、硬质，适合作为最后精制步骤除去痕量杂质，可用于生物分子（包括重组蛋白、单克隆抗体、DNA、病毒和肽类）的色谱分离。其多羟基表面涂层具有较低的非特异性结合能力和不同的表面化学结构。POROS AEX显示出较好的杂质去除能力，表2显示POROS HQ 50 显示出较好的DNA去除能力和较高的载量。表3显示出POROS HQ 50较高的病毒清除能力。

表 2  阴离子填料或膜包DNA和载量对比

表 3  阴离子填料病毒清除能力对比

3.规模化储存及灌装

生物工艺过程中，不管是培养基、缓冲液或收获液等液体，都需要生物储运容器提供如:配液前后的液体储存和转移，或工厂内部或工厂之间的液体储存和转移等用途在下游生产工艺过程中，赛默飞提供的储运系统是经美国运输测试协会确认的一次性储运容器并且可以支持50mL至3000L的储运规模。（表4）

表4 储液解决方案

4. 抗体表征分析与检测

抗体表征分析与检测对于抗体药物的生产至关重要，并且贯穿整个流程。在前期阶段，抗体药物研发过程中需要分析测试，工艺开发与放大过程中，更需要质量控制把关。赛默飞提供完全的生物表征（图17），包括完整分子量，聚体，电荷异构体，糖型，亚基，二硫键以及肽图分析等结构表征与修饰分析、蛋白质含量、纯度分析、结合检测、生物学活性、杂质检测与分析和安全性检测等极其广泛的平台和解决方组合，可满足抗体表征分析与检测的需求（表5）。

图17 抗体表征分析与检测

表5 表征方案

5.实验室自动化，通用设备和耗材&生物安全防护

赛默飞不仅提供前期的工艺设计、产品分析以及整个生命周期的项目管理及验证服务，同时提供实验室设备和配套试剂耗材，全面满足平台的硬件、自动化软件要求（图18）。

图18 实验室设备

伴随着人类后基因组学及代谢组学时代的到来，抗体表达系统不断完善，细胞培养条件不断改进，纯化水平不断提高，其生产成本也逐渐降低，但这不仅依赖于方法创新和工艺优化，同时也依赖于创新性的设备、原材料、介质等从根本上破除技术障碍。最后，以优质的装备及成熟的技术做保障，相信在生物制药人的共同努力下抗体药物的市场迎来新的繁荣。

参考文献

1) FLi,JXZhou,XYang.Currenttherapeuticantibodyproductionandprocessoptimization[J].BioprocessingJournal,2005,5(4):16.

2) HuiF.Liu,JunfenMa,CharlesWinter,etal.Recoveryandpurificationprocessdevelopmentformonoclonalantibodyproduction[J].mAbs,2010.

3)HakemeyerC,McknightN,St.JohnR,etal.ProcesscharacterizationandDesignSpacedefinition.[J].Biologicals,2016:306-318.

4)McCueJT,SelvitelliK,WalkerJ(2009)ApplicationofanovelaffinityadsorbentforthecaptureandpurificationofrecombinantfactorVIIIcompound.JChromatogrA.1216(45):7824-30.

5) 赛默飞抗体药物整体解决方案

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