优美不完美——基因编辑行业研究报告

一、基因编辑治疗简介

目前有6000多种疾病被确认与基因组异常相关，包括常见单基因疾病镰刀贫血症、血友病等以及其他罕见病。在中国，罕见病患者的数量也在逐年攀升。2015年，我国罕见病患者总人数约为1680万人，到了2020年，这一数据上涨到2000万人，95%以上的罕见病没有有效的治疗手段。通过基因编辑可以实现基因的修正，从而治愈疾病，在集中技术平台上，第三代基因编辑技术，CRISPR／Cas9 系统，体现出效率高，且在多个物种有效的特性，得以迅速在各领域应用，Emmanuelle Charpentier和Jennifer A.Doudna也因为此技术获得了2020年诺贝尔化学奖。

CRISPR技术尽管是一种令人兴奋的革命性技术，是一个优美的工具，然而这个工具绝非完美，自诞生时起，CRISPR就伴随着脱靶性的担忧。实际上，随着基因编辑技术的优化，脱靶性已不是其面临的最大问题，而更多的风险因素逐渐开始暴露，基因编辑在临床应用最基础的要求就是准确性与安全性。作为涉及DNA层面的遗传操作，基因编辑的副作用对病人造成的伤害无疑是可怕的，因此基因编辑技术进入临床使用需要慎之又慎，科学界对于准确性和安全性更高的基因编辑工具的追求也从未停止。

二、基因编辑治疗逻辑

基因编辑（gene editing）是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行定点“编辑”，实现对特定DNA片段的修饰。

对于基因功能缺失的遗传病的治疗，最根本的办法是把出错的基因找出来并进行纠正，使其恢复到正常的状态，从微观角度看，基因编辑的过程可分为三个步骤：定位、切除、修补。

（1）定位异常基因：基因编辑的第一步也是最重要的一步就是在DNA上找到需要进行编辑的位置。人类基因组DNA的大小在3Gb左右，在如此庞大的基因组中准确找到几个甚至一个出错的碱基是非常困难的，因此需要一套精准的定位系统来快速锁定剪切的部位。

（2）切除异常基因片段：定位到目标位置以后，需要把错误的基因片段切除，这个过程主要通过内切酶来实现。目前科学家已经发现了许多种类的内切酶，也从中找到了适用于基因编辑的内切酶，如Fok I。

（3）修补恢复成正常基因：内切酶把错误的基因片段切除后，会在DNA上形成一段缺口，只需要把对应的正确基因片段插入到这个缺口中并与原DNA进行连接即可完成DNA的修复。这个过程原本非常复杂，但细胞偏偏自带这种功能。为了维持自身DNA的稳定，在几十亿年的生物进化过程中细胞进化出了一套“DNA修复系统”，科学家则巧妙地利用生物体自带的“DNA修复系统”实现了这个“修补”过程。简单地说，人体细胞的DNA是双拷贝的，当一条DNA出现异常时，这套修复系统会以另一条同源DNA为模板，对错误的DNA进行修复。当人为地把外源DNA（含需要插入的基因）导入细胞时，DNA修复系统会误以为该外源DNA是自身同源DNA，并以此为模板对剪切后的DNA进行修复，从而实现目的基因的插入。

三、基因编辑工具分析

在整个基因编辑过程中，“准确定位”是最困难的，也是目前所有的基因编辑技术最核心的差异所在；“剪切”已经成功实现；“修补”的过程虽然复杂，但借助于细胞自带的DNA修复系统也基本上解决了这个问题，所以难度也不大。因此，基因编辑技术只需要完成“定位”和“剪切”这两个步骤就行了。经过几十年的发展，目前的基因编辑技术主要可分为锌指核酸酶技术（ZFN）、转录激活样效应因子核酸酶技术（TALEN）、成簇规律性间隔的短回文重复序列技术（CRISPR）、碱基编辑四大类。

图表1：基因编辑工具比较

资料来源：智银资本

3.1 锌指核酸酶技术（ZFN）：开基因编辑先河，但是存在操作难度和专利垄断等问题。

锌指核酸酶技术（ZFN）诞生于1996年，由细胞内天然存在的具有准确识别和结合特定DNA序列功能的转录因子衍生而来。一个锌指核酸酶由DNA识别域和DNA剪切域两部分组成。

ZFN技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。1986年Diakun等首先在真核生物转录因子家族的DNA结合区域发现了Cys2-His2锌指模块，到1996年，Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。2005年，Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN可识别24bp的特异性序列，由此揭开了ZFN在基因组编辑中的应用。ZFN由锌指蛋白(ZFP)和FokⅠ核酸内切酶组成。其中，由ZFP构成的DNA识别域能识别特异位点并与之结合，而由FokⅠ构成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA断裂(DSB)。于是，细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复DNA。HR修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰，而NHEJ修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。

与转基因的基因治疗方法相比，ZFN的主要优势在于基因修复方式多样、精准更换基因、对基因表达强度影响较小。但是，ZFN的劣势主要有设计/筛选过程复杂、“可编辑性”仍然较低、存在脱靶风险、细胞毒性较大等。除了技术上的问题，ZFN发展面临更大的问题是专利上的封锁。

3.2 首个真正意义上的基因“可编辑”工具

转录激活样效应因子核酸酶技术（TALEN）发明于2011年，由AvrBs3蛋白衍生而来。TALEN的工作原理与ZFN类似，核心元件的结构也类似，均由DNA识别域和DNA剪切域组成。转录激活样效应因子核酸酶通过DNA识别域结合到特定的DNA序列上，再由Fok I核酸内切酶构成的DNA剪切域对靶基因进行剪切，最后利用细胞自带的DNA修复系统完成基因编辑。TALEN与ZFN的区别在于DNA识别域对DNA序列的识别模式。在ZFN中，每个锌指蛋白识别一个DNA三碱基序列；在TALEN中，每2个氨基酸组合对应着一个特定的碱基。因此，通过人为的删减、添加和自由组合不同的氨基酸组合，科学家可以轻而易举地构造出结合特定DNA序列的蛋白，从而实现转录激活样效应因子核酸酶在人类基因组DNA上的精确定位。

与ZFN相比，TALEN在多个方面表现出明显的优势：工具蛋白设计更简便、可编辑性高、成本降低、细胞毒性降低。相对于ZFN，TALEN尽管已经有了明显的进步，也解决了ZFN一直存在的核心难题，但还有一些缺陷：（1）TALEN的工具蛋白不能通用，针对不同的基因仍需要设计特定的转录激活样效应因子核酸酶；（2）脱靶效应导致的潜在安全风险；（3）技术使用成本仍然偏高。

3.3 CRISPR：上帝的手术刀

成簇规律性间隔的短回文重复序列技术（CRISPR）于2012年由麻省理工大学的华人科学家张峰和加州大学伯克利分校的珍妮弗独立发明。CRISPR是原核生物基因组内的一段重复序列，是生命进化历史上细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR-Cas9系统，利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除，这是细菌特有的免疫系统。

细菌拥有多种切除外来病毒基因的免疫功能，其中比较典型的模式是依靠一个复合物，该复合物能在一段RNA指导下，定向寻找目标DNA序列，然后将该序列进行切除。许多细菌免疫复合物都相对复杂，其中科学家掌握了对一种蛋白Cas9的操作技术，并先后对多种目标细胞DNA进行切除。这种技术被称为CRISPR/Cas9基因编辑系统，迅速成为生命科学最热门的技术。该技术具有非常精准、廉价、易于使用，并且非常强大的特点。

与ZFN和TALEN相比，CRISPR系统的优势主要体现在系统设计简便、可实现多基因编辑等。以CRISPR/Cas9为例，发挥DNA剪切功能的Cas9元件是通用的，因此只需要根据靶基因的不同设计相应的gRNA即可，其设计难度和复杂度远低于ZFN和TALEN，大大拓展了CRISPR系统的应用前景。此外，CRISPR还具有基因编辑效率更高、操作成本低等多方面的优势。然而，CRISPR技术出现时间还太短，科学家还无法充分预估其潜在风险。相比CRISPR技术，TALEN的脱靶效应更低，更加稳定。

图表2：Crispr／Cas9编辑过程

资料来源：智银资本

CRISPR/Cas作为基因编辑系统被应用最早开始于2012年。Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier通过体外实验证明：成熟的crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成特殊的双链RNA结构，指导cas9蛋白在目标DNA上引起双链断裂。在与crRNA指导序列互补的位点，cas9蛋白的HNH核酸酶结构域切割crRNA的互补链，而cas9蛋白RuvC样结构域切割非互补链。当双tracrRNA：crRNA被嵌合到一条RNA时，同样可以指导cas9切割双链DNA。她们的研究证明，在双链RNA指导下切割双链DNA断裂的内切酶家族并揭示了CRISPR/Cas系统在RNA指导下进行基因编辑的巨大潜力。

传统CRISPR带来的双链DNA断裂是业界持续且非常关注的安全性风险，CRISPR基因编辑是一个优美的工具，然而这个工具绝非完美。自诞生时起，CRISPR就伴随着脱靶性的担忧。实际上，随着基因编辑技术的优化脱靶性已不是其面临的最大问题，而更多的风险因素逐渐开始暴露。

对于准确性来说，CRISPR基因编辑技术自诞生以来，脱靶效应始终令人担忧，脱靶性通常是由于对DNA的错误切割造成的，除了提高CRISPR系统靶向的精准性以外，开发DNA切割活性丧失的dCas9，以及不依赖DNA双链断裂的单碱基编辑器也重要的方向。

对于安全性来说，人体对细菌来源的Cas9蛋白的免疫原性反反应，CRISPR-Cas9激活p53引起的DNA损伤，引起染色体大片段缺失，以及引起p53失活突变的富集等等，都是CRISPR在人体上应用的巨大障碍。

CRISPR-Cas9还会导致包括大片段缺失在内的各种复杂的染色体结构异常乃至染色体整体缺失；CRISPR-Cas9基因编辑会破坏细胞核结构，导致微核和染 色体桥的出现，最终导致染色体碎裂。

4.4 碱基编辑

如何精准、高效地对基因组进行修饰是生命科学领域研究的重要目标，而CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术成为实现该目标的最强工具。传统的CRISPR/Cas9技术通过在靶点处产生DNA双链断裂(DSB)，从而诱发细胞内的同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)修复途径，进而实现对基因组DNA的定点敲除、替换、插入等修饰。然而，DSB引发的DNA修复很难实现高效稳定的单碱基突变。

单核苷酸变异会导致大约2/3人类遗传病的发生，也是许多动植物重要性状变异的遗传基础，因此开发一种精准且能够高效实现单碱基替换的技术尤为重要。

此时大家更为期待的是一把更为精准的手术刀，单碱基编辑技术让大家看到希望，碱基编辑工具的功能不再拘泥于Knockout基因:碱基编辑工具通过修改某个特定碱基可实现更多基因编辑的可能性:直接将突变碱基修复为1）野生型碱基 2)将某个蛋白突变为“具有治疗意义”的突变类型 3)依然具备CRISPR基因编辑的沉默基因的功能 4)可进行多位点编辑。碱基编辑工具通过突变Cas蛋白从而避免双链DNA的断裂。

David Liu实验室开发了三种不同的碱基编辑器，分别是胞嘧啶碱基编辑器(CBE)、腺嘌呤碱基编辑器(ABE)和先导编辑器(Prime Editor)，这些碱基编辑器在工作时不依赖DSB的产生，也不需要供体DNA的参与。

图表4：胞嘧啶碱基编辑器

资料来源：Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage

图表5：腺嘌呤碱基编辑器

资料来源：Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage

图表6：先导编辑器

资料来源：Peter J. Chen et al., (2021), Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes, Cell

四、基因编辑——未来远不止于此

作为生命科学发展迅速的重要研究领域，基因编辑技术的开发及应用使得生物体的遗传改造进入了前所未有的深度与广度，也是世界范围内竞争最为激烈的下一代核心生物技术，在建立疾病模型、靶向基因治疗和合成生物学等方面都带来了丰富的想象力，随着基因编辑研究的爆发式发展，基因编辑技术这一革命性技术一经问世就冲击到生命科学的各个研究领域。

图表7：中心法则

资料来源：智银资本

围绕着中心法则，基因编辑在包括癌症、心血管疾病（如冠状动脉疾病）、遗传性疾病（如血友病）、 神经退行性疾病、艾滋病和白血病、染色体疾病（如唐氏综合征）等的方面都带来了巨大的想象力。

NASDAQ给予基因编辑公司估值都非常高，下表列举了部分基因编辑公司的基本信息，Cripsr和碱基编辑让基因编辑变得更为简单以及更为灵活，赋予了基因编辑平台技术的想象空间，相信未来基因编辑会作为一项重要部件嵌入到大部分的生物制药公司来。

图表8:基因编辑公司

资料来源：智银资本整理

参考资料

[1] Jiang, T., Zhang, XO., Weng, Z. et al. Deletion and replacement of long genomic sequences using prime editing. Nat Biotechnol (2021). https://doi.org/10.1038/s41587-021-01026-y

[2] Choi, J., Chen, W., Suiter, C.C. et al. Precise genomic deletions using paired prime editing. Nat Biotechnol (2021). https://doi.org/10.1038/s41587-021-01025-z

[3] Peter J. Chen et al., (2021), Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes, Cell, DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.09.018

[4] New CRISPR tools could fix diseases caused by large DNA rearrangements, scientists report, Retrieved October 14, 2021, from https://www.statnews.com/2021/10/14/new-crispr-tools-could-fix-diseases-caused-by-large-dna-rearrangements-scientists-report/

[5]药明康德，同日三篇重磅论文！基因编辑领域迎来新突破

[6]生物世界，基因编辑的未来遭质疑，因严重安全问题，FDA暂停基于基因编辑的CAR-T临床试验

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