不育男性的全外显子组测序队列研究揭示与精子头部缺陷相关的畸形精子症的新致病基因

近日四川大学华西第二医院生殖医学联合实验室沈英副研究员与四川大学华西第二医院生殖医学科杨镒魟副教授，在生殖医学权威期刊Human Reproduction 杂志上发表了一篇题为《Whole-exome sequencing of a cohort of infertile men reveals novel causative genes in teratozoospermia that are chiefly related to sperm head defects》（IF=6.9）的文章。通过149名不育男性的全外显子组测序（WES）研究，发现了与精子形态异常相关的罕见和新的有害基因变异，并重点关注了头部畸形候选基因突变对其蛋白质构象和（或）表达的影响，研究了人类和小鼠精子发生过程中基因的时空表达/定位，探索了它们与已知参与精子发育的蛋白质的相互作用。在畸形精子症特别是头部畸形相关的新致病基因挖掘方面，做出了重要工作。此外，作者发现了头部畸形精子比尾部畸形精子的ICSI受精率明显要低。

文章根据招募的男性不育患者的精子形态，分为了头部畸形（82例）与尾部畸形（67例）两大类，进行全外显子测序。生信分析及sanger验证后，头部畸形组筛选出精子发育或者顶体功能相关基因12个（表1），部分未见报道；尾部畸形组检测出12个与精子鞭毛形态异常（MMAF）相关基因，其中7个属于动力蛋白轴索重链（DNAH）家族成员，并在DNAH2、DNAH10 和DNAH12 中发现了新的突变位点，DNAH1 对应的比例最高。

表一 精子头部畸形候选基因列表

SEPTIN属于一个高度保守的与多聚GTP结合的细胞骨架蛋白家族。Septin12þ+/-嵌合雄性小鼠精子表现出独特的形态学缺陷，呈现圆形的头部、缺陷的顶体以及卷曲的尾^[1]。在人类病例报道中，携带SEPTIN12 突变的男性不育患者精子表现为弯曲的尾巴、有缺陷的颈部和变形的头部，但尚不清楚这些患者是否表现出顶体发育不全^[1]。在本研究中，作者报道了两名SEPTIN12 中检出有害杂合变异的患者(图A)，精子形态检测显示头部形态异常，顶体完全或部分缺失（图B、图C、图D）。实验进一步对SEPTIN12蛋白进行定位，结果显示正常精子发育过程中该蛋白在精子头部及颈、尾表达，并与PNA（peanut agglutinin）共定位于顶体（图E）；而患者精子中SEPTIN12蛋白在精子顶体表达缺失（图F、图G）。因此，作者的数据表明SEPTIN12 基因的功能丧失突变是顶体异常的新遗传原因。

图A患者家系图及sanger验证结果 图B巴氏染色显示精子呈现梨状头，顶体破损 图C精子扫描电镜 图D透射电镜图。

图E SEPTIN12蛋白荧光定位结果 图F 小鼠精子发育过程中SEPTIN12蛋白进行定位结果 图G人生精上皮细胞中SEPTIN12蛋白定位结果

CCNB3在人的睾丸内高表达，并在小鼠模型中报道了与精子细胞形态相关^[2]，但尚无患者病例报道。本次实验报道在一名圆头精子症患者中检测到了一个CCNB3 的半合子移码突变c.1862dupT (图A),突变导致患者精子中该蛋白表达下降（图B）。小鼠精子与人的生精上皮细胞进行免疫荧光实验，显示CCNB3与PNA共定位在顶体部位（图C），参与精子发生。Co-IP 实验发现与DNAH17 的相互作用(图D)，实验数据表明CCNB3 突变与精子头部的发育异常相关。

图A患者家系图及sanger验证结果 图B WB分析突变型CCNB3在患者精子中表达降低 图C 人生精上皮细胞中CCNB3蛋白进行定位 图D 人精液裂解液中Co-IP结果

KIAA1210在睾丸中特异性表达，定位于顶体，被认为参与精子的细胞连接^[3]，但与精子头部畸形的关系并不确定。本次在两名精子头部畸形患者中检出KIAA1210 一种罕见的c.3418G>T[p.E1140*]的半合子无义突变（图A）。患者的精子呈现顶体缺陷，呈圆头或梨行头（图B-D）。与正常对照组相比，患者的精子头部几乎检测不到KIAA1210和PNA信号，其中KIAA1210染色与精子头部的PNA明显共定位（图E）。此外，我们观察到KIAA1210在人和小鼠的圆形精子细胞形成过程中开始与PNA共定位，直到精子成熟（图F和G）。这些数据显示KIAA1210 可能是精子发生过程中顶体形成和精子头部成形所必需的，该基因可以被认为是顶体发育不良的一个新的致病基因。

图A患者家系图及sanger验证结果 图B巴氏染色显示精子顶体异常，精子头部梨形或圆形 图C精子扫描电镜 图D透射电镜图。图E KIAA1210蛋白荧光定位结果 图F 小鼠精子发育过程中KIAA1210蛋白进行定位结果 图G人生精上皮细胞中SEPTIN12蛋白定位结果

CHPT1与高尔基体相连，位于囊泡中。高尔基体衍生的囊泡融合和运输到精子头部顶端区域是顶体生物发生的先决条件。本次研究在一名典型圆头精子症患者中检出CHPT1变异（图A-D）。免疫荧光染色显示，在该患者的精子头部，CHPT1几乎不表达，同时PNA染色缺失，而正常对照精子显示CHPT1在精子头部与PNA重叠（图E-F）。这些数据表明CHPT1在顶体形成中起着至关重要的作用，CHPT1的功能缺失突变可能导致圆头精子。

图A患者家系图及sanger验证结果 图B巴氏染色显示为典型的圆头精子 图C精子扫描电镜 图D透射电镜图。图E CHPT1蛋白荧光定位结果 图F小鼠精子发育过程中CHPT1蛋白进行定位结果 图G人生精上皮细胞中CHPT1蛋白定位结果

文章从一名圆头精子患者P2中检出PIWIL4变异（图A-D）。免疫荧光染色显示，正常对照组精子头部PIWIL4与PNA共定位，而患者P2精子中PIWIL4的信号强度较低，PNA染色几乎缺失（图E）。PIWIL4和PNA在人类和小鼠精子发生过程中的共定位（图K和L），表明PIWIL4 在精子头部形成和顶体生物发生中起着关键作用。

图A患者家系图及sanger验证结果 图B巴氏染色显示为典型的圆头精子 图C精子扫描电镜 图D透射电镜图。图E PIWIL4蛋白荧光定位结果 图F小鼠精子发育过程中PIWIL4蛋白进行定位结果 图G人生精上皮细胞中PIWIL4蛋白定位结果

具有梨状头精子的患者P38检测出CC2D1B中一个错义突变（图A），这是一个跨不同物种的高度保守位点（图B）。c.1277G>c（p.R426P）突变改变了CC2D1B蛋白的结构，丰富的随机线圈构象被短a-螺旋取代（图C-D）。我们进一步观察到，这种错义突变导致突变CC2D1B蛋白的表达降低（图E）。遗憾的是，该患者没有精液样本可用于进一步的功能研究。人类精子发生过程中观察到CC2D1B和DPY19L2在精子头部的共同表达（图F）。之前的文章报告CC2D1B和DPY19L2共定位^[4]，人精子裂解液中通过免疫共沉淀分析检测CC2D1B和DPY19L2之间存在相互作用（图G）。这些发现表明CC2D1B在精子头部形成中具有明确的作用，但需要在小鼠模型或更多病例研究中进一步证实。

图A患者家系图及sanger验证结果 图B保守性分析 图C图D野生型与突变型CC2D1B蛋白结构预测。图E WB检测CC2D1B蛋白表达 图F人精子发育过程中PIWIL4蛋白荧光定位结果 图G人生精上皮细胞中CC2D1B蛋白定位结果

此外，文章还对畸形精子症患者的ICSI结局进行了追踪，上文提及的检出CCNB3、KIAA1210、CHPT1、PIWIL4、CC2D1B 变异精子头部畸形患者，除了CC2D1B突变携带者获得了持续的临床妊娠，其它均以移植失败或者流产告终。整体而言，与MMAF组相比，异常精子头部组的受精率降低（分别为 85.2% 和 79.6%；P=0.038）。异常精子头部组的持续妊娠率低于对照组和MMAF组，但差异不显著。

综上，作者从畸形精子患者的队列研究到候选基因筛选，实验验证，以及ICSI结局的追踪，做了大量的工作。尤其对于精子头部畸形的致病基因挖缺，做了非常亮眼的工作。总结而言，有以下特点：

作者对于入组队列的患者进行了详细的形态学观察，对患者进行了形态学分组：圆形精子症患者16例，顶体小或缺陷21例，梨形头精子10例，无定形头精子13例，小头精子8例，锥形头精子14例，并要求每位患者的特殊形态的头部异常精子比例超过60%。准确统一的形态学特征为后续的新基因挖掘奠定了良好的基础。

 (A)巴氏染色图，比例尺：10 mm。(B)扫描电子显微镜图(SEM)，比例尺：5mm。(C)透射电子显微镜图(TEM)。IAM，顶体内膜；OAM，外顶体膜；PM，质膜。比例尺：500 nm。Round 圆头、pyriform 梨形头、small顶体小或者缺陷、tapered 小头或锥形头、amorphous 无定形头。

文章对头部畸形患者进行WES检测以后，筛选指标过程中，将是否在睾丸中特异表达，是否与精子的发生相关，以及小鼠模型是否有相关功能验证作为重点考量指标（表一）。并通String数据库预测过蛋白互做网络图，找到候选基因与已报道基因之间的关系，文章关注的CCNB3、SEPT12、PIWIL4、CC2D1B 都在同一调控网络，在精子头部发生过程发挥作用。

图 精子头部形成相关蛋白互作网络图

文章多次使用免疫荧光实验检测候选基因的蛋白在人及小鼠精子发生中的表达变化。该实验细胞材料分别取材于8周龄C57BL雄性小鼠（DOSSY，中国成都）的生精小管及一位患有梗阻性无精子症的不育男性的睾丸组织，通过细胞裂解液的处理获得了不同阶段的生精细胞，用于实验分析。该实验的操作性强，结果直观展示了候选指标在精子发生过程中的重要作用，队列研究中多个候选基因功能验证都做了相关验证，工作相对细致。同时也为后期的小鼠功能实验奠定了很好的基础。