Mol Cell | 李姗/傅暘课题组揭示病原细菌感染催化的新型蛋白质翻译后修饰ADP-核糖脱氨环化的分子机制

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利用Ⅲ型分泌系统 （Type III Secretion System， T3SS ） 向宿主“注射”效应蛋白，模拟或操纵宿主的信号转导通路，促进侵染和定殖，是许多革兰氏阴性病原细菌的核心感染策略。近期，北京生命科学研究所邵峰院士/北京大学基础医学院刘小云教授联合团队，与华中农业大学李姗教授课题组分别在研究中发现T3SS效应蛋白OspC3和CopC能够催化全新骨架的蛋白质翻译后修饰，暨精氨酸-ADP核糖脱氨环化修饰，作用于宿主细胞caspase蛋白家族，抑制caspase的半胱氨酸蛋白酶活性，从而调控凋亡、坏死和焦亡等多种程序性细胞死亡 （详见BioArt报道：Nature亮点 | 邵峰/刘小云团队揭示病原菌抑制宿主细胞焦亡的新机制——全新的蛋白质翻译后修饰、Mol Cell | 李姗实验室揭示病原菌通过蛋白质翻译后修饰ADPR-deacylization调控程序性细胞死亡的新机制） 【1-3】 。值得注意的是，这一新颖的蛋白质翻译后修饰，需要在人类宿主特异存在的钙调蛋白 （Calmodulin，CaM） 帮助下完成，保证了病原细菌毒力蛋白只在进入宿主后才发挥功能。

2022年11月23日，李姗课题组与南方科技大学傅暘课题组合作在Molecular Cell在线发表题为 Structural insights into caspase ADPR-deacylization catalyzed by a bacterial effector and host calmodulin  的论文。研究人员利用单颗粒冷冻电镜技术成功捕捉到CaM-CopC-caspase-3三元复合物与配体NAD⁺在反应前、反应中和反应后三种状态下的高分辨率结构， 揭示了病原菌通过ADPR-deacylization修饰caspase调控程序性细胞死亡的分子基础，为开发相关细菌感染性疾病药物提供了新靶点和理论基础。

CopC由N端的催化结构域 （N-terminal catalytic domain, NCD） 以及C端的锚蛋白重复结构域 （ankyrin repeats domain，ANK） 构成。通过同源结构比对，研究人员发现CopC的整体结构与数据库现有蛋白结构相似度不高，但其 NCD所包含的6个β折叠片层和ADP-核糖转移酶 （ADP-ribosyltransferase，ART） 的核心催化域类似，然而与经典的含有”H-Y-E”或者”R-S-E”基序的ART不同的是，CopC通过其特有的”H-F-F-D”基序来结合和催化NAD⁺的水解。CopC的整体结构形似一只手：NCD的N端向外延伸的螺旋结构代表大拇指；NCD的其余部分代表手掌；ANK结构域的四对螺旋结构代表4个手指。CopC通过ANK形成的手指抓住底物caspase-3，同时caspase-3的活性区域 （包含修饰位点R207所在loop区） 贴在NCD形成的手掌上。辅助因子CaM则像一个扳指套在CopC的大拇指上 （图1） ，调节催化反应活性。

图1. CaM-CopC-caspase-3三元复合物结构

Caspase-3中修饰位点R207所在的loop结合在NCD表面的一片疏水区域，R207的侧链则穿过NCD表面，延伸至NAD⁺的烟酰胺核糖 （N-ribose） 附近。与此同时，CopC上一个高度保守的天冬氨酸D172与R207形成氢键相互作用，将R207的侧链稳定在N-ribose附近。在已知的精氨酸ADP-核糖化过程中，一般是由精氨酸上的NH₂对 NAD⁺中的烟酰胺进行亲核取代，连接至N-ribose的C1原子上。然而caspase-3 R207上的NE（N^δ）原子比NH₂（N^ω）更接近N-ribose的C1原子。NAD⁺的水解进一步缩短了N-ribose C1与R207 NE的距离，促进亲核取代反应的发生，使ADP-核糖基团转移至R207的NE原子上。随后N-ribose的2’-OH被活化，进攻精氨酸侧链胍基的碳原子，引发脱氨和环化反应，从而完成精氨酸的ADPR-deacylization修饰。

此项研究还捕捉到了反应完成后caspase-3将要从CopC上分离的状态。通过对不同状态下结构的比较分析，研究人员发现CopC NCD上存在两个非常特殊的loop, 这两个loop同时参与了CopC NCD与NAD⁺以及ANK的结合。随着酶学催化反应的进程 （NAD⁺水解和ADP-核糖脱氨环化反应) ，这两个loop的构象发生变化，引起NCD与ANK相互作用面的改变, 进而导致与ANK结合的caspase-3发生转动并远离NCD，最终造成caspase-3从CopC上分离。

真核宿主中特异存在的钙调蛋白CaM是如何帮助CopC发挥功能的呢？研究人员比较CopC-caspase-3二元复合物和CaM-CopC-caspase-3三元复合物的结构发现，在有CaM存在时，CopC的NCD催化结构域才可正确折叠、有序组装。体外生化分析表明，Ca²⁺-free形式的CaM能够明显促进CopC催化活性，增进与底物caspase-3的结合能力。这一发现与宿主细胞静息状态处于低钙环境是一致的。研究人员在细胞中上调或下调钙调蛋白的表达量，对病原菌感染时CopC的活性有对应的调控作用。紫色色杆菌感染小鼠模型中也表明CopC与CaM的结合能力，对病原菌在小鼠肝脏的定殖和对小鼠的感染致死能力至关重要。

综上所述，该研究解析了CopC对配体/底物/辅因子的识别机制、CopC对底物进行ADPR-deacylization修饰的催化机制以及反应完成后底物的分离机制；完整揭示了CaM在低钙环境下，通过调节CopC结构而促进其酶学活性的分子机制，证实CaM在病原细菌感染时协助毒力蛋白发挥功能。

南方科技大学傅暘课题组张阔博士，华中农业大学李姗课题组博士研究生彭婷、陶新元，南科大傅暘组田苗博士为本文共同第一作者。李姗教授和傅暘研究员为本文共同通讯作者。

南方科技大学傅暘课题组、华中农业大学李姗课题组现均有博士后岗位开放，面向全球招聘。诚挚欢迎有微生物生理生化、细胞生物学、免疫学、结构生物学、类器官或生物信息学等背景的优秀博士毕业生加入，共同挑战面向感染性疾病的重大科学问题。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.10.032

制版人：十一

参考文献

1 Li, Z. et al. Shigella evades pyroptosis by arginine ADP-riboxanation of caspase-11. Nature 599, 290-295, doi:10.1038/s41586-021-04020-1 (2021).

2 Peng, T. et al. Pathogen hijacks programmed cell death signaling by arginine ADPR-deacylization of caspases. Mol Cell 82, 1806-1820 e1808, doi:10.1016/j.molcel.2022.03.010 (2022).

3 Liu, Y. et al. Calmodulin Binding Activates Chromobacterium CopC Effector to ADP-Riboxanate Host Apoptotic Caspases. mBio 13, e0069022, doi:10.1128/mbio.00690-22 (2022).

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