即将开播：纳米孔测序癌症研究应用进展系列2——神经系统肿瘤

测序技术在临床研究中的广泛应用使人们对基因组学在人类健康中的作用有了前所未有的认识。在这些应用当中，绝大多数采用了短读长测序技术。然而，短读长测序技术限制了人们对大量致病基因变异的研究，例如结构变异，重复序列，定相，融合转录本，可变剪切，及碱基修饰等。纳米孔测序为全景解析人类基因组变异提供了高准确度、快速、可及的解决方案。

那么，纳米孔测序癌症研究应用进展如何？5月24日，我们邀请到德国基尔大学医院、德国马克思-普朗克研究所、德国癌症研究中心和泰国国立玛希隆大学的研究人员分享他们利用纳米孔测序技术对神经系统肿瘤分型，预后标志物研究等方向的研究成果！（注：此次分享会为英文演讲）

嘉宾简介

FRANZ-JOSEF MÜLLER

德国基尔大学医院 神经精神疾病学家

专注于将尖端分子技术、细胞生物学手段与生物信息技术方法相结合，开发可用于临床研究的检测方法。他曾带领团队开发了干细胞研究的预测性分析技术（www.pluritest.org），并与Oxford Nanopore Technologies合作，共同研究基于Cas9的神经精神疾病的富集与分析策略。

HELENE KRETZMER

德国马克思-普朗克研究所 基因组调节部生物信息学负责人

专注于利用单细胞RNA和全基因组甲基化测序来研究、调控哺乳动物早期胚胎发育的表观遗传因素，以及了解癌症的表观遗传足迹。她研发了用于DNA甲基化测序的分析方法，并将其应用于癌症数据分析。

AREEBA PATEL

德国癌症研究中心（DKFZ）及海德堡大学医院 博士研究员

在帝国理工学院攻读硕士期间，她从事早期卵巢癌中逆转录研究。在剑桥大学癌症基因组期间，曾从事液体活检的亚克隆变体检测工作，这使她对分子诊断学产生了浓厚的兴趣。

在Sahm实验室（Sahm Lab）期间，她开发了Rapid-CNS，这是一个使用纳米孔测序适应性采样技术对中枢神经系统肿瘤进行全面描述的系统，它有助于明显减少周转时间，提升分析效率。

THIDATHIP WONGSURAWAT

泰国国立玛希隆大学 Siriraj医学系长读长测序实验室负责人

专注于利用纳米孔测序技术进行癌症研究，重点关注将基因组数据及新观点转化为临床实践。目前，她正与一个由科学家及临床医生组成的多学科团队密切合作，开展基于纳米孔测序技术的新项目，研发应用于癌症诊断及治疗的尖端解决方案。

演讲摘要

基于Oxford Nanopore 甲基化谱分析的实时脑瘤分型

图例 | 纳米孔DNA甲基化分析（NDMA）用于快速、详细的脑瘤分型。NDMA工作流程时间线，包含各步骤所需时间范围2。

 

基于DNA甲基化谱对神经系统肿瘤分型的有效性已得到了较广泛的研究认证。然而，当前基于甲基化芯片的分析方法时效性不强，且一般需要单次检测大量样本来满足经济效益，无法满足临床上实时、快速、甚至在手术期间按需完成脑瘤分型的需求。2021年来自欧洲的多组研究人员分别发表了基于纳米孔测序甲基化谱分析进行实时脑瘤分型的文章和案例。

其中一组研究人员基于低通量纳米孔测序，结合5mC和CNV谱，开发了基于机器学习的针对82种脑瘤分型的特定算法。在对111个实验个体的验证分析中，特异性达到了100%。且在不同实验室间表现出了极高的稳定性1。

另一组研究人员基于上述研究和算法，进一步优化了实验流程，将整体实验周期缩短至中位97分钟。在对来自6个群体的105个临床研究样本的分析中，93例与神经病理评估一致。对6例病理学无明确结论的样本也做出了正确的分类。在对20个手术过程中获取的活检样本进行评估分析后，其中12例活检样本的分子分型结果可能会指导不同的手术处理方案2。

发表文献：

1.Robust methylation-based classification of brain tumors using nanopore sequencing

DOI: https://doi.org/10.1101/2021.03.06.21252627

2.Intraoperative DNA methylation classification of brain tumors impacts neurosurgical strategy

DOI: https://doi.org/10.1093/noajnl/vdab149

Rapid-CNS2: 单一检测全面覆盖神经肿瘤中的突变、甲基化特征、拷贝数变异

中枢神经系统肿瘤因其形态和分子水平上的高度异质性，是最难治疗的一类肿瘤。2021 WHO 中枢神经系统肿瘤分类推荐包含多种分子标志物。而要全面评估这些分子标志物需要大量人力物力的投入，以及较长周期的等待收集大量样本用于高通量测序和甲基化分析。研究人员开发了基于纳米孔选择性测序（adaptive sampling），对中枢神经系统肿瘤的分子标志物进行全面评估的方案—Rapid-CNS2。该方案对目标区域进行靶向选择性测序，使用单一检测全面、快速评估目标区域突变、甲基化特征、及拷贝数变异，且无需额外建库流程优化，方便对样本进行个性化panel设计和分析。

对22例弥漫性胶质瘤样本进行分析，并与对应的NGS panel和EPIC甲基化芯片分析结果进行比较。拷贝数谱系结果与EPIC芯片结果完全一致；94%的特异性突变与NGS panel结果一致；MGMT启动子区域甲基化水平在全部样本中得到正确评估。在WHO 2021分类推荐标准中相关的变异标志物中，97%的变异在全部样本中有效检出，可保证全部样本的无争议分类。

目前该流程的周期为5天，但随着纳米孔测序技术的更新，研究人员将进一步优化流程，目标将周期缩短至24小时内。纳米孔测序技术为简化中枢神经系统肿瘤分型提供了快速、高效、低成本的集成化分子分型方案，为急重症快速诊断应用场景提供了重要的选项。

发表文献：

Rapid-CNS2: Rapid comprehensive adaptive nanopore-sequencing of CNS tumors, a proof of concept study

DOI: https://doi.org/10.1101/2021.08.09.21261784

同步靶向检测IDH1/2突变及MGMT甲基化，以及更多

IDH1/2基因突变是弥漫性胶质瘤的重要分类以及预后分子标志物，MGMT启动子区域甲基化水平可用于指导化疗用药。上述两类分子标记物是弥漫性胶质瘤诊疗过程中最常检测的标记物。但目前检测这两类标记需要使用不同的技术手段实现，且在不同国家、甚至不同地区使用的技术手段都不尽相同。因此，研究人员希望开发一种基于单一技术，对两种分子标记物同事进行分析的方法。

基于纳米孔Cas9目标区域测序，研究人员可实现以上预期，并可将对MGMT的甲基化水平评估扩展到启动子临近区域，获取更全面信息。该方案与临床上现有的技术手段分析结果高度一致，且更加快速、简便、成本更低。

研究人员近期还将检测标志物范围扩展到最近加入WHO2021分类推荐的 CDKN2A/B 缺失—目前还没有针对该标记的检测手段。通过使用纳米孔低深度测序，对拷贝数变异进行分析，可以快速检测到该位点的缺失（最快在8分钟就得到了答案），且与现有的技术（如FISH, EPIC芯片，NGS全基因组测序）分析结果100%一致。

发表文献：

A novel Cas9-targeted long-read assay for simultaneous detection of IDH1/2 mutations and clinically relevant MGMT methylation in fresh biopsies of diffuse glioma

DOI：https://doi.org/10.1186/s40478-020-00963-0

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