点评 | 张明杰（中国科学院院士、南方科技大学）、Chris Xu（ 康奈尔大学）
大脑是高等生命体最复杂的器官。在其自然状态下实现对神经元、神经胶质细胞和微血管系统的非侵入式活体高分辨成像对于促进理解大脑生理机能和疾病至关重要
【1】
。为了实现这一目标，研究人员一直致力于研发能穿过颅骨的大脑活体成像技术。虽然超声成像、正电子发射断层扫描、磁共振成像等技术都能对大脑进行无损成像，但却无法提供足够的空间分辨率来解析亚细胞水平的生物结构和功能。光学显微镜的独到之处在于能够以高空间分辨率提供活体样本的结构和功能信息。然而，当光波在不均匀生物组织
（例如哺乳动物颅骨和大脑组织）
中传输时就会遇到组织产生的光学像差和散射，从而限制了光学成像的分辨率和深度。近年发展的三光子显微镜
(3PM)
技术是一种使用长激发波长和高阶非线性激发的光学成像方法。与其他光学成像技术相比，3PM有效地减少了散射和背景荧光，在对哺乳动物大脑成像方面已经显示出巨大的潜力
【2】
。然而，不透明的颅骨和脑组织仍然会严重衰减激发和发射光子并产生光学像差和散射，从而降低成像质量和深度
【3】
。自适应光学
(AO)
是一种校正光波波前畸变的方法，最早用于大型天文望远镜排除大气产生的像差实现高分辨成像。近10多年AO 已被应用于光学显微镜领域，通过校正组织像差来提高成像分辨率
【4】
。然而，传统AO技术的波前测量精度和像差矫正准确性都随着成像深度的增加迅速下降。因此，如何在弱信号和大散射情况下准确测量并矫正像差对于在组织深层实现高分辨成像是一个巨大的挑战。
香港科技大学瞿佳男/叶玉如研究组在近年发展了多项AO显微成像技术这基础上
（Sciences Advances 2020，Light: Science and Applications 2020, Photonics Research 2021）
，于2022年6月12日在 Nature Biotechnology 杂志上在线发表了题为
Deep tissue multi-photon imaging using adaptive optics with direct focus sensing and shaping
的研究论文，
报道了一种新型活体自适应光学三光子显微成像 (AO-3PM) 系统。该系统结合全新自适应光学技术和三光子显微成像，实现了穿过活体小鼠完整头骨在大脑深层的高分辨率大视场成像。AO-3PM大幅提升了非侵入式活体成像的图像质量，为无损研究大脑结构和功能提供了又一强有力的工具。
在这项工作中研究工作者发明了一种称为analog lock-in phase-detection for focus sensing and shaping
(ALPHA-FSS 或 -FSS)
的AO技术，对激发光的相位进行特定调制，再利用相敏探测方法对生物组织引入的低阶和高阶像差进行快速精确测量及矫正
（图1）
。实验证明-FSS技术能够在大背景噪声情况下显著提高测量的信噪比，直接得到激发光在显微镜焦面的电场幅值和相位，并用于准确校正小鼠头骨及大脑组织产生的像差和部分散射。不仅如此，AO-3PM系统还包括另一套共轭自适应光学技术，用于克服矫正波前和生物组织像差随着扫描角度变大迅速解耦的问题，显著扩大了-FSS的矫正有效范围和高分辨成像的视场。
图1：-FSS-3PM系统及对100um厚小鼠头骨引起的像差矫正。(A) AO-3PM系统结构图。(B) 100um厚的头骨下300um深处荧光珠在X-Y平面和X-Z平面的图像，未矫正组织像差（左），-FSS矫正组织像差（右）。(C) 空间光调制器上的矫正图案。(D) B图中沿虚线荧光信号轮廓。比例尺：(B) 2um。
研究人员使用1300nm波长的飞秒脉冲激光作为激发光验证了AO-3PM的成像性能，展示了穿过小鼠完整头骨的体内和体外成像。与传统的三光子显微成像相比， AO-3PM 能够获得更高的空间分辨率，并提升在小鼠大脑深层荧光信号强度最高达数百倍。凭借对低阶和高阶像差的矫正能力，AO-3PM可以在保留完整头骨的情况下能够清晰分辨深皮质区的神经元胞体和树突以及微血管的精细结构，实现了穿过小鼠完整头骨在软脑膜下方750 µm深处的无损高分辨率成像
（图 2）
。研究者还发现AO-3PM在大幅提升神经元胞体钙离子信号的同时，更能清晰提取出单独树突钙离子信号，从而可以同步记录神经元胞体树突间的电信号关联。在去除头骨后AO-3PM还可获得在软脑膜下方达 1.1 mm深度的海马体高分辨率结构图像。
图2：AO-3PM实现活体穿过头骨对大脑皮质的大范围高分辨成像。(A) Thy1-YFP转基因小鼠大脑内150X150X780um^3范围内对黄色荧光蛋白（YFP）标记的神经元（橙色）和Texas Red Dextran标记的微血管（红色）的高分辨成像。(B) 椎体神经元的最大强度投影（脑膜下方545-555um），未矫正组织像差（上），-FSS矫正组织像差（下）。比例尺：(B) 大图20um，小图5um
最后，研究人员利用 AO-3PM 在保留完整头骨情况下实现了精密激光损伤，并以此研究了微小损伤后大脑皮质内小胶质细胞的响应过程
（图3）
。结果显示AO-3PM成像可清晰分辨小胶质细胞突起向微米级激光损伤点伸张和包裹的完整过程，有助于研究活体状况下免疫细胞对大脑环境变化的动态反应。同时，研究还表明AO-3PM产生的精密微小激光损伤只引起局部免疫细胞的迅速反应，而100微米外相邻大脑皮质的小胶质细胞并不会发生形态和位置的变化。为了验证在更大像差和散射情况下AO-3PM的性能，研究人员进一步对老年阿兹海默症老鼠大脑的小胶质细胞和淀粉样斑块进行活体成像。结果显示穿过其140um厚的完整头骨，AO-3PM仍然能清晰分辨胶质细胞的精细形态和与淀粉样斑块的相互作用。
图3：AO-3PM实现活体穿过头骨精确激光手术以及老年阿兹海默症老鼠大脑内对小胶质细胞高分辨成像。(A) 激光手术后对Cx3Cr1-GFP转基因老鼠内被绿色荧光蛋白标记的小胶质细胞间隔时间成像。(B) 空间光调制器上的矫正图案。(C) A图中沿虚线荧光信号轮廓。(D) 在12个月大的老年阿兹海默症老鼠大脑对小胶质细胞和淀粉样斑块的双色成像。比例尺：(A) 20um；(D) 10um。
总体而言，
这项研究结果表明，AO-3PM 技术在促进活体生物高分辨成像特别是在活体大脑无创成像研究方面具有巨大潜力。
https://doi.org/10.1038/s41587-022-01343-w
张明杰
（中国科学院院士）
人脑是最复杂的人体器官，人脑的研究也是最前沿的研究领域之一。近年来，以小动物为模型的各种影像学技术已经成脑科学研究不可或缺的工具。以亚细胞分辨率对小动物大脑的生物结构和生物过程进行活体光学成像为研究脑功能及脑疾病提供了一种有效手段。
为了达到大脑亚细胞分辨率的活体成像，研究人员通常通过开颅手术或颅骨减薄这两种微创手术来制作光学成像窗口。在开颅手术中，一小部分颅骨被盖玻片取代，为大脑成像提供清晰的光学通路。然而，这一过程可能会对生理环境造成干扰。例如，手术过程中的机械应力可以诱导小胶质细胞和星形胶质细胞的激活并改变大脑的神经免疫系统，开颅过程也可能会改变颅内压力并影响血管旁的液体流动，因此很多情况下
（如研究与免疫系统功能障碍相关的脑部疾病，包括阿兹海默症、帕金森病、多发性硬化症等）
开颅手术并不是一种理想的方法。相对而言，颅骨减薄技术侵入性较小，通常可以降低大脑的损伤，颅骨减薄手术后可立即进行皮层成像，但由于机械磨薄后的颅骨表面和颅骨大脑界面的不规则性，难以在组织深处获得高分辨率的图像。尽管一个极薄的颅骨（~5 μm）可以提供接近开颅窗口的成像分辨率，其对皮层的破坏和引发神经免疫的概率也会相应增加，此外过度变薄的颅骨不适合长时间的活体成像实验。
近日，香港科技大学瞿佳男教授实验室和叶玉如教授合作在
Nature Biotechnology
报道了一种新的自适应光学显微技术，该技术能够实现穿过完整小鼠头骨在脑膜下方到750μm的深处进行高分辨成像以及去除头骨后脑膜下方深达1.1mm处进行高分辨成像，并在大脑深处记录了神经元的自发响应以及精确激光损伤后小胶质细胞的动态变化。这一研究为活体非侵入式脑功能成像研究提供了强有力的工具，该技术有望帮助研究者在活体、非侵入情况下长时间观察和研究动物大脑皮层不同深度的神经元及突触在各种生理或病理状态下结构和功能的变化。特别值得一提的是瞿佳男实验室多年来深耕光学成像技术的研究及在生命科学中特别是活体状态下功能研究的应用，取得了一系列原创性的成果。该实验室开发的多种成像技术被业界广泛应用。而这些工作都基于与生物学家的长期交流合作。
Chris Xu
（ 康奈尔大学，三光子显微镜发明人）
光学显微成像技术的不断发展推动了不少生物研究的重大突破。双光子显微镜技术（2PM）是目前活体小动物脑成像最常用的方法，但是随成像深度的增加荧光信号及信号背景比均呈指数下降。最近，三光子显微镜技术（3PM） 在非侵入式组织深处成像上显示出巨大的潜力。相较于传统的2PM，3PM使用更长的波长和更高阶的非线性激发机制，大大减小了散射和背景噪声。近年来，国际上数十个研究小组报导了利用三光子显微技术在小鼠大脑深处成像的结果，其成像深度和成像质量相对于2PM都有显著提升。然而，与 2PM 一样，3PM 仍然受限于生物组织中的折射率变化而产生的像差，这些像差导致激发光无法形成衍射极限焦点，降低了其空间分辨率和激发效率。最终限制了多光子成像技术在无创条件下对深皮层和皮层下的亚细胞结构进行高分辨成像。
近年来自适应光学
(AO)
已被引入光学显微技术以矫正生物样本引起的光学像差，从而在组织深处恢复最佳的成像效果。用于像差矫正的波前测量方法可分为直接或间接两类。直接波前传感能够利用生物组织内荧光导星信号对像差进行快速测量，但这一方法的性能依赖于准弹道光子的信号量。随着成像深度的增加，其性能会迅速下降。间接传感方法设计了各种算法来确定
最佳校正波前。其更适用于不透明组织，但通常耗时且主要处理低阶光学像差。
最近，香科大瞿佳男/叶玉如团队在Nature Biotechnology上报道了一种名为-FSS的新型自适应光学技术。基于严格理论分析，该技术巧妙地应用多光子干涉调制和相敏感解调，直接测量激发光在焦面的电场强度和相位。这对在大散射背景下快速准确测量并矫正高低阶像差至关重要。将-FSS和3PM相结合后，充分利用了三光子激发的低散射特性，作者实现了穿过完整小鼠头骨对大脑进行无损高分辨成像。为了扩大-FSS的矫正范围，作者基于小鼠头骨为像差和散射主要来源这一特点，研发了针对头骨像差和散射的共轭自适应光学系统， 克服了传统孔径自适应光学在视场边缘矫正波前和像差不匹配的问题，显著提高了其矫正效率，高分辨成像视场扩大了数倍。从结果来看，文章报道的新技术结合了-FSS，共轭自适应光学和三光子显微镜等方法，实现穿过完整小鼠头骨在脑膜下方750um深处的亚细胞结构成像以及去除头骨后脑膜下方1.1mm深处的亚细胞结构成像，将非侵入式大脑深层高分辨成像技术向前推进了一步。希望这一新技术将在神经科学领域发挥重要作用。
制版人：十一
1. Hua-Tai X, Pan F, Yang G, Gan W. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat Neurosci. 2007;10(5):549.
2. Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures of an intact mouse brain. Nature Photonics 7: 205-209 (2013).
3. Wang, T. et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nat. Methods 15, 789–792 (2018).
3. Hampson, K. M. et al. Adaptive optics for high-resolution imaging. Nat Rev Methods Primers 1, 68 (2021).
【非原创文章】本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经作者的允许禁止转载，作者拥有所有法定权利，违者必究。
个人中心
我是园区
退出
