Nat Commu+CRISPR J | 陈佳/杨力/黄行许/孙晓东/李潇飒合作对导向编辑系统进行安全性评估和升级改造

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关键词：合作

资讯来源：BioArt

发布时间： 2022-04-02

除了利用细菌CRISPR/Cas核酸酶直接构建的基因编辑技术，近年来研究人员也将核酸酶结构域突变的CRISPR/Cas蛋白与核酸脱氨编辑酶或反转录酶整合发展出了新型碱基编辑系统（Base Editor，BE）和导向编辑系统（Prime Editor，PE），其可在单碱基水平实现精准高效的靶向性基因编辑。2019年报道的新型PE系统包含两个组分：Cas9切刻酶与逆转录酶的融合蛋白和包含写入信息的引导pegRNA。pegRNA在原始sgRNA上添加了与断裂的靶DNA链3’末端互补序列（p rimer-binding site ， PBS）和携带写入信息的逆转录模版（re verse transcription-template，RTT），其可以介导全部12种类型的碱基转换、最长达40余碱基对的插入、80余碱基对的缺失，以及结合以上不同类型的DNA编辑。尽管有着广泛的应用前景，但是PE在全基因组和全转录组水平的非靶向突变及其在不同位点处的编辑效率差异制约着PE在基础科研和临床研究中的推广。

2022年3月14日，上海科技大学生命学院基因编辑中心陈佳研究组和复旦大学生物医学研究院杨力研究组分别与上海科技大学生命学院黄行许研究组和上海市第一人民医院孙晓东研究组合作在CRISPR Journal上发表了文章“ Genomic and Transcriptomic Analyses of Prime Editing Guide RNA–Independent Off-Target Effects by Prime Editors ”， 建立了一种可以在细胞水平检测和分析PE系统在全基因组和全转录组范围内脱靶效应的方法，证实PE系统逆转录酶部分在开展编辑过程中的高度特异性。 2022年3月29日，又在Nature Communications上发表了“ Genomic and Transcriptomic Analyses of Prime Editing Guide RNA–Independent Off-Target Effects by Prime Editors ”， 通过规律性引入同义突变和pegRNA骨架优化，开发了新型导向编辑系统sPE和aPE。

脱靶问题长期困扰着基因编辑领域的发展和应用。虽然已有报道表明PE系统只会产生少量的pegRNA依赖性的脱靶突变；但是其是否会在人类细胞中产生另外一种可能存在的更为严重的与pegRNA序列无关并难以预测的随机突变：pegRNA非依赖性的脱靶突变亟待验证。为了全面有效地评估PE的脱靶效应，科研人员首先在293FT细胞中通过敲除内源性APOBEC3 （Apolipoprotein B mRNA-editing enzyme, catalytic polypeptide-like type 3）基因构建了一种背景突变数量极低的细胞系293FT ^A^3-/- ，在该细胞系中分别检测PE3、hA3A-BE3以及Cas9编辑过的单克隆细胞中的突变数量，并在全基因组和转录组范围内分析PE3的编辑特异性（图1A）。同时，结合基因组和转录组数据对端粒完整性、内源性逆转录作用元件的活性、可变剪接事件的发生以及基因表达模式改变等进行了全方位的比对和分析，科研人员发现PE3在靶位点处介导高效编辑的同时（图1B），并未在全基因组（图1C）和全转录组（图1D）范围内检测到PE3产生的pegRNA非依赖性的脱靶效应，证明了PE3系统的高特异性（Gao et al, CRISPR J 2022）。这些结果为利用PE3开展高精度的基因编辑应用提供了理论基础。

与此同时，科研人员也对PE系统的升级改造进行了有益的探索。针对PE介导的单碱基转换，科研人员通过在RTT中规律性的引入同义突变，开发了spegRNA并与PE3系统整合构建了sPE3。与原始版本的PE3相比，sPE3显著提高了碱基转换效率。通过分析同义突变的数量、位置、碱基转换类型等因素，得出引入1到2个同义突变，且位于1，5，6或同时位于2和5，3和6位时，可以获得效率最高的spegRNA。在论文中检测过的靶向位点处，优化的spegRNA可将碱基转换效率平均提高353倍（最高提高4976倍），并在原始版本的PE3无明显编辑（编辑效率低于3% ）位点处将编辑效率提高至40%到80%。

针对PE3介导的碱基精确插入/缺失，科研人员通过分析pegRNA骨架，将发夹结构中G/A改造为C/G碱基对，通过提高了pegRNA稳定性建立了apegRNA，并将其与PE3系统整合构建了aPE3，在论文中检测过的靶向位点处将PE3介导的碱基插入/缺失效率平均提高了2.77倍，最高提高10.6倍（图3）。同时，spegRNA和apegRNA联合使用可进一步提高碱基转换和插入/缺失效率，spegRNA和apegRNA也能够与PE5系统整合（sPE5与aPE5）并提高PE5的编辑效率（Li et al, Nat Commun 2022）。

上述两项导向编辑系统的安全性评估和升级改造研究为PE系统在基因治疗领域的广泛应用提供了理论基础和科学依据。在第一项研究中，陈佳研究组2016级博士生高润泽、杨力研究组2019级硕博连读研究生 付志灿 和黄行许研究组2018级硕博连读研究生 李向阳 为共同第一作者，陈佳、杨力、 黄行许 为共同通讯作者。在第二项研究中，孙晓东研究组副研究员 李潇飒 、陈佳研究组2018级硕博连读研究生 周丽娜 和杨力研究组2019级硕博连读研究生 高宝青 为共同第一作者，陈佳、杨力、 孙晓东 、 李潇飒 为共同通讯作者。

CRISPR Journal论文链接：

https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/crispr.2021.0080

Nature Communications论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-022-29339-9

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