专家点评Science两连发丨柴继杰/常俊标等合作解析跨越生命之树的TIR防御——填补植物免疫受体研究的巨大空白

点评 | 周俭民（中科院遗传与发育学研究所）

撰文丨十一月

责编丨酶美

生物的先天免疫系统会在应对病原体和有害刺激时候迅速动员起来【1-2】。从对动物和植物先天性免疫的研究中，科学家们发现进化上保守的TIR结构域（The Toll/Interleukin-1/Resistance-gene）。TIR结构域可以作为支架组装信号复合体并转导防御反应，这一结构域的免疫功能广泛存在于生命王国中。最近的研究发现TIR结构域可以作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+水解酶发挥作用，在植物中的研究发现TIR结构域可以做作为水解NAD+以及DNA/RNA的双功能水解酶【3】。

图1 跨越生命王国的TIR结构域在免疫功能中的作用

TIR结构域的识别起始于三个关键基因的鉴定，分别是哺乳动物中IL-1R、果蝇中的Toll以及烟草中的N蛋白，这些基因都能够促使烟草抵抗烟草花叶病毒。N蛋白末端具有TIR结构域，是一个TIR- NRL受体，简称为TNL。它通过识别烟草花叶病毒的一种蛋白质而被激活，导致高度敏感的程序性细胞死亡并限制病毒的复制。随后的研究发现广泛分布在双叶植物基因组中的一个细胞内植物TNL受体超家族。但是TNL激活后作为NAD+水解酶产生的信号分子类型以及该信号分子如何调节下游抗病信号通路的仍不清楚。

为了揭开这些问题的答案，清华大学和科隆大学柴继杰教授课题组，德国马克斯-普朗克植物育种研究所Jane E. Parker教授课题组、郑州大学和河南师范大学常俊标教授课题组合作在Science发表了两篇研究论文，分别为Identification and receptor mechanism of TIR-catalyzed small molecules in plant immunity和TIR-catalyzed ADP-ribosylation reactions produce signaling molecules for plant immunity，通过高分辨率结构解析鉴定发现了在植物免疫中TIR结构域催化小分子以及产生抗病信号分子的具体反应过程，为揭开TIR结构域作为酶发挥免疫功能的分子机制拿下重要一城。

为了抵御多种不同病原微生物的侵染，植物进化出了高效、密切关联的两层防御体系：模式识别分子引起的免疫反应（Pattern-Triggered Immunity，PTI）和效应因子引起的免疫反应（Effector-Triggered Immunity，ETI）。具有TIR结构域的NLRs（Nucleotide-binding leucine-rich repeats）类受体蛋白主要在ETI中发挥主导作用。TIR-NLR信号途径发挥作用需要协助者NRG1（NLRs N requirement gene 1）、ADR1（Activated disease resistance 1）以及EDS1（Enhanced disease susceptibility 1）以及PAD4（Phytoalexin Deficient 4）、SAG101（Senescence-associated gene 101）形成复合体发挥作用，可以组成两条免疫通路：TNL-EDS1-PAD4-ADR1以及TNL-EDS1-SAG101-NRG1。但是TIR结构域相关的酶活性催化产生的化学产物协调免疫信号途径的过程仍然未知。

为了鉴定催化产生的信号分子，作者们在昆虫细胞中共表达了TNL-EDS1-PAD4-ADR1免疫通路，通过对电子云密度分析结合高分辨液相质谱，确认了结合在EDS1-PAD4上的小分子为pRib-ADP（图1），通过对复合体结构分析，作者们发现了EDS1-PAD4识别pRib-ADP小分子的具体氨基酸位点，EDS1以及PAD4两者对于pRib-ADP小分子的识别均具有重要贡献。

图2 EDS1与PAD4复合体中存在的一团不属于两者的小分子电子云：pRib-ADP

那么TIR包含的蛋白的激活是否会因此pRib-ADP/AMP小分子激活呢？作者们使用拟南芥中唯一的TIR包含蛋白RBA1进行验证，RBA1会通过ADR1促进EDS1-PAD4的相互作用。但液相色谱-质谱实验发现超过50%的pRib-AMP以及超过的90%的pRib-ADP会在与植物组织裂解产物共孵育后的一个小时内降解。作者们在EDS1-PAD4体系中共表达野生型RBA1后，发现pRib-AMP出现了明显的累积；但是在与NAD水解酶突变型RBA1共表达时，pRib-AMP的累积则会显著降低。这说明pRib-ADP/AMP小分子会在的TIR激活的植物组织中累积并结合在EDS1-PAD4复合体之中。

既然pRib-ADP/AMP是EDS1-PAD4复合体小分子配体，进一步地作者们想知道EDS1-PAD4复合体的激活过程。通过2.93埃高分辨率结构解析，作者们发现pRib-ADP/AMP的结合会导致EDS1-PAD4复合体构象的变化进而激活该复合体促进的植物免疫过程的进行。

在另一篇工作中，作者们发现在昆虫细胞中共表达TNL-EDS1-SAG101-NRG1免疫通路，含有TIR的蛋白质通过所具有的类ADPR聚合酶和NAD水解酶活性催化ADP与ATP和二磷酸腺苷核糖ADPR，分别形成ADPr-ATP和ADPr -ADPR （diADPR）（图3）。在体外实验以及植物体中，ADPr-ATP或di-ADPR变构特异性结合可促进EDS1-SAG101与NRG1A的相互作用，特异性激活EDS1-SAG101-NRG1免疫分支通路。

图3 EDS1-SAG101-NRG1免疫分支通路中的小分子ADPr-ATP或di-ADPR

图4 TIR 催化两种不同小分子来调控两条免疫通路

总的来说，两篇背靠背的工作揭开了TIR结构域包含的蛋白在植物中通过催化不同的小分子来调控免疫通路的高分辨率结构生物学机制，为深入理解植物免疫以及植物的抗逆抗病提供了重要的理论依据。自Jeffery Dangl等人提出抗病信使以来，首次发现了植物免疫信使分子。TIR结构域广泛存在于生命王国这种，也是动物先天免疫与发育信号通路中的中转适配器，该研究将有助于对进化多样性的免疫系统的理解提供新的思路。

另外，Science杂志同期刊发了国际植物免疫权威科学家Marc T. Nishimura以及Jeffery Dangl撰写的题为Shared TIR enzymatic functions regulate cell death and immunity across the tree of life的综述评论文章，高度评价了这一重大突破型成果并对TIR结构域的酶活性在免疫功能中的作用进行了全面的总结。

专家点评

周俭民 （中国科学院遗传与发育学研究所）

TIR结构域蛋白在多界生物中承担了重要且丰富的功能。在动物固有免疫中，TLR受体和TIR接头蛋白作为结构蛋白组织形成信号复合体，激活下游信号通路，调节机体的炎症和防御反应。随后动物SARM1 TIR结构域NAD水解酶功能发现，TIR结构域的酶活功能在细菌、古细菌和植物界都有所发现。

植物TIR结构域蛋白TNL是NAD水解酶，是植物抗病免疫通路的重要的受体蛋白。目前报道的所有TNLs抗病蛋白的信号传递都需要EDS1，EDS1通过与PAD4或者是SAG101分别形成异源二聚体来介导不同的植物抗病通路。在本期Science杂志上，柴继杰团队发表了背靠背的两篇文章，解析了EDS1-PAD4和EDS1-SAG101两个信号枢纽的晶体和电镜结构。通过共表达TNLs，在昆虫细胞中重组EDS1复合体和下游RNL成员，发现了其特异的别构调节小分子：pRib-ADP/AMP和ADPr-ATP/ADPR。两类小分子可由不同的TNL蛋白水解NAD形成，不同的信号分子激活两类EDS1复合体，产生不同的植物免疫效应。

抗病小体的第二信使找到了

免疫受体是植物免疫研究的最前沿，也是作物抗病育种的关键所在。柴继杰团队10年来通过结构生物学，解析了一系列细胞表面免疫受体的作用机制；最近几年更是在胞内NLR类免疫受体研究中捷报频传，先后解析了两类NLR蛋白形成的不同抗病小体结构。在本期Science杂志上，柴继杰团队、常俊标团队与马普育种所的Jane Parker合作发表了背靠背的两篇文章，发现了NLR免疫受体途径的两类全新的关键信号分子。

含有TIR结构域的NLR蛋白(TNLs)在植物NLR类免疫受体中占了半壁江山。它们的功能，通过EDS1、PAD4和SAG101三个脂酶样蛋白以及下游ADR1和NRG1两个助手NLR蛋白执行。近期发现，TNLs，EDS1家族蛋白和ADR1还在细胞表面免疫受体途径中发挥作用。因此，TNL-EDS1家族蛋白-ADR1/NRG1信号轴在植物免疫中具有极为重要的意义。已知TNL类抗病小体的TIR结构域具有NADase酶活，推测该酶活通过产生未知信号分子，结合并激活EDS1家族蛋白，进而招募并激活ADR1和NRG1。鉴定这些未知信号分子是植物免疫研究中的重大难题之一。柴继杰与Jane Parker团队最近的研究，巧妙的利用生化和结构生物学手段，从纯化的EDS1家族蛋白中，获得了与之结合的两类小分子信号分子，pRibADP/pRibAMP和diADPR/ADPr-ATP，前者通过结合EDS1-PAD4二聚体，招募并激活 ADR1，后者通过结合EDS1-SAG101二聚体招募并激活NRG1。进一步的结构生物学和生化分析，阐明了TIR结构域催化合成这些信号分子的机制以及这些信号分子激活EDS1家族蛋白的机制。有趣的是，之前发现的NAD水解活性只是这些信号分子合成的一部分。由NAD水解产生的二磷酸腺苷核糖(ADP-ribose)，进一步在TIR催化下与ATP或ADP反应，产生ADPr-ATP或diADPR，TIR还可进一步通过水解酶活性将这两个分子转化为pRibADP或pRibAMP。

这些信号分子的发现，使得我们对TNL-EDS1家族蛋白-ADR1/NRG1信号轴的认识，完成了从遗传学到生化机制的飞跃，填补了植物免疫受体研究的一个巨大空白。这些发现，还为设计新型生物农药提供了崭新的思路。

原文链接：

1. http://doi.org/10.1126/science.abq3297
2. http://doi.org/10.1126/science.abq8180

制版人：十一

参考文献

1. S. Akira, S. Uematsu, O. Takeuchi, Pathogen recognition and innate immunity. Cell 124, 783–801 (2006). doi:10.1016/j.cell.2006.02.015 Medline

2. P. C. Ronald, B. Beutler, Plant and animal sensors of conserved microbial signatures. Science 330, 1061–1064 (2010). doi:10.1126/science.1189468 Medline

3. K. Essuman, D. W. Summers, Y. Sasaki, X. Mao, A. K. Y. Yim, A. DiAntonio, J. Milbrandt, TIR domain proteins are an ancient family of NAD+-consuming enzymes. Curr. Biol. 28, 421–430.e4 (2018). doi:10.1016/j.cub.2017.12.024 Medline

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