NBT新方法丨无需扩增，实现长链RNA修饰直接测序——Nanopore direct RNA-seq新算法

撰文 | H菌

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RNA修饰种类众多，到目前为止，已鉴定的RNA修饰超过百种。其中N6-甲基腺嘌呤（m⁶A）是真核生物mRNA修饰的主要形式【1】。m⁶A修饰酶的鉴定和RNA修饰测序技术的发展极大地推进了人们对于m⁶A生理功能的认识。目前较为常用的m⁶A高通量鉴定技术无论是基于m⁶A特异性抗体识别的m⁶A-seq还是非抗体依赖性的检测方法（例如：m⁶ACE-seq ，m⁶A-REF-seq，m⁶A-label-seq等）都利用了二代测序技术（next-generation sequencing technology, NGS）【2】。然而二代RNA测序技术存读长较短，依赖mRNA反转录和PCR扩增，系统偏向性的缺陷。近年来新兴的纳米孔测序技术能够对长链RNA直接测序（nanopore direct RNA-sequencing），无需 PCR 扩增，可以同时在核苷酸序列中识别碱基修饰【3,4】。

2021年7月19日，来自于新加坡A*STAR基因研究所的Jonathan Göke 研究组在Nature Biotechnology杂志上发表了题为Identification of differential RNA modifications from nanopore direct RNA sequencing with xPore的论文，开发了一种基于nanopore direct RNA-seq的RNA修饰差异化分析计算方法xPore。xPore可以实现单碱基水平（single-base resolution ）的甲基化位点鉴定、甲基化水平计算，在没有配对未修饰样品对照组的情况下进行样品间的甲基化差异分析，xPore为临床样本、原代培养组织等缺乏相应对照组的甲基化差异分析提供了技术支持。

当RNA通过纳米孔时，由于碱基的电荷影响，会短暂地改变流过纳米孔的电流强度(current signal)，Nanopore测序技术通过检测电流的变化以此来鉴定出所通过的碱基以及RNA修饰。xPore利用基于两种高斯分布的混合模型（two-Gaussian mixture model）对样品中的修饰RNA reads和未修饰RNA reads的Nanopore signal进行模拟，利用已知的未修饰RNA reads的Nanopore signal建立theoretical signal distribution来辅助高斯混合模型的建立，进而计算出样品中modified RNA reads所占比例（modification rate）。

研究团队首先将该方法应用于wild-type（WT）和m⁶A甲基转移酶 METTL3敲除（METTL3-KO）HEK293T细胞转录组m⁶A的鉴定。结果表明，nanopore direct RNA-seq/xPore鉴定的m⁶A位点与基于二代测序的m6ACE-seq （m⁶A-cross- linking-exonuclease sequencing ） 结果高度一致，90% xPore鉴定出的显著性m⁶A位点（top significant 1500 positions）与DRACH motif (D=G/A/U, R=G/A, H=A/U/C，最常见的m⁶A motif) 或者其他已知m6A位点高度重合。为检测xPore的性能，研究者利用WT 和METTL3-KO细胞配置了一系列不同m⁶A水平的RNA样品并对其进行nanopore direct RNA-seq。实验结果显示，xPore在m⁶A低浓度样品（modification rate=25%）中仍然可以有效地识别修饰化位点，xPore较为准确地计算出了不同m⁶A水平样品的甲基化修饰modification rate （+/-7% of the expected rate）。此外，xPore还计算了WT和METTL3-KO的之间的differential modification rates （DMR），发现了例如SF3B3，GLUL， MRPL10等未报道的m⁶A差异变化基因。

研究团队将该方法进一步应用于多种癌症细胞系和临床癌症样品。xPore结果显示，测试的5种不同种类的癌症细胞中多数m⁶A位点一致，其中白血病细胞系K562甲基化位点最多。临床样品的遗传背景多样性和样品的珍贵性在一定程度上限制了高通量测序技术的应用。在本项研究中，作者仅使用了2.5 μg 的骨髓瘤临床样品total RNA（direct RNA-seq 推荐量：50 μg）用于xPore m⁶A位点检测，利用METTL3-KO HEK293T细胞作为未修饰对照进行xPore模型建立，克服了临床样品缺乏相应对照组的问题。

综上，该研究开发了一种基于Nanopore direct RNA测序的RNA甲基化差异分析计算方法，实现了单碱基水平的m⁶A修饰位点鉴定，样品的m⁶A水平计算，并且在不依赖于相应未修饰对照组存在的情况下进行样品之间的RNA甲基化差异分析，为研究疾病发展中m⁶A的生理功能提供了技术支持。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41587-021-00949-w

制版人：十一

参考文献

1. Roundtree, I. A., Evans, M. E., Pan, T. & He, C. Dynamic RNA modifications in gene expression regulation. Cell 169, 1187–1200 (2017).

2. Zhao, L.-Y., Song, J., Liu, Y., Song, C.-X. & Yi, C. Mapping the epigenetic modifications of DNA and RNA. Protein Cell 11, 792–808 (2020).

3. Leger, A. et al. RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing. http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/843136 (2019) doi:10.1101/843136.

4. Garalde, D. R. et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nat. Methods 15, 201–206 (2018).

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