推进CAR-T细胞治疗实体瘤的创新策略

在过去的几十年中，基因改造的CAR T细胞取得了令人兴奋的成就。特定CAR的添加使T细胞能够以MHC独立的方式鉴定特定肿瘤细胞。第四代CAR可以释放转基因产物，并具有增强的增殖能力和抗肿瘤功效[1]。通过过继输注CAR T细胞消除恶性血液病已取得显著成果，特别是在实现B细胞淋巴瘤和白血球持续性疾病消退方面[2-4]。FDA随后批准了两种针对B细胞肿瘤抗原的CD19 CAR T细胞产品，以对抗复发或难治性B细胞恶性肿瘤，掀起了CAR T细胞研究的高潮[5，6]。这些成就刺激了进一步应用CAR T细胞疗法对抗实体瘤的探索，并启动了许多临床前或临床研究来评估CAR T细胞的作用[7-10]。然而，CAR T细胞治疗实体瘤的当前结果仍然不能令人满意。

假设有几种因素造成了血液系统恶性肿瘤和实体瘤临床影响的显着差异。缺乏独特的肿瘤抗原和异质抗原表达是导致副作用和抗原逃逸的关键因素[11]。而且，由于实体瘤内血管系统的紊乱和基质的致密性，输注后将CAR T细胞从血液运输到肿瘤部位是困难的[12]。此外，敌对的肿瘤微环境（TME）是另一个明显的障碍，严重阻碍了CAR T细胞的功能和持久性[13]。为了克服与实体瘤相关的挑战，已开发出各种策略，包括优化的CAR结构和创新的联合疗法，旨在增强CAR T细胞的特异性，渗透性和功效，并对抑制条件进行重新编程。在这篇综述中，将详细阐述实体瘤带来的主要挑战以及支持CAR T细胞疗法的可行策略。

CAR T细胞靶标的选择

 在肿瘤细胞上选择合适的靶点非常关键，不仅会影响CAR T细胞对肿瘤细胞的准确识别和清除，还会影响肿瘤的安全性治疗。由于某些靶标的正常组织也可能表达非特异性的肿瘤抗原，因此有可能受到靶标和肿瘤外毒性对正常组织的损害[16]。为了提高安全性并减少脱靶毒性，许多注意力集中在优化具有改善的肿瘤抗原选择性和特异性的CAR构建体上。

一种提高特异性的方法是设计双特异性CAR T细胞 ，其信号通路分别连接至共刺激信号和激活信号（图1A）。只有当CAR T细胞同时遇到两种在肿瘤上表达的抗原时，T细胞才能被激活以产生强大的作用[17]。

同样，还研究了提高控制CAR T细胞在特定条件下打开或关闭它们的能力（图1A）。 开关CAR T细胞被设计为仅在可诱导外来分子存在的条件下才有条件激活的策略准确控制CAR T细胞的活化。通过将CAR的关键识别和激活信号划分为不同的模块才能实现这种效果，这些模块只能与异二聚化小分子的应用相结合[18]。使用由叶酸和氟树脂异硫氰酸酯（叶酸-FITC）组成的双功能小分子“开关”，CAR T细胞可以特异性地识别过度表达叶酸受体的肿瘤细胞[19]。

随后，一些研究提出了另一种抑制T细胞功能的方法，如果该毒性反应是通过工程自杀基因或使用抗体介导的杀伤而发生的，也称为非开关CAR T细胞[20，21]。

肿瘤抗原异质性和肿瘤抗原逃逸

实体瘤由分子异质亚组组成，不同肿瘤或个体中的抗原表达不同。异源靶抗原的表达限制了CAR T细胞治疗的结果，并与随后的克隆逃逸，肿瘤抵抗力和去除大多数免疫原性表位后的复发有关[23]。已证明在复发性胶质母细胞瘤患者中，由肿瘤抗原丧失引起的肿瘤抵抗力表皮生长因子受体（EGFR）靶向CAR T细胞疗法[24]。因此，解决肿瘤异质性和克服肿瘤逃逸对于实现长期缓解是必不可少的。

最近，研究人员一直致力于设计多靶CAR T细胞，旨在通过识别多种抗原来抑制肿瘤抗原逃逸。串联CAR T细胞具有两个scFV，可识别连接至一个CAR构建体的不同抗原（图1B）。一组在成胶质细胞瘤小鼠模型中比较了共表达HER2和IL13Rα的串联CAR T细胞与单特异性CAR T细胞的作用，发现前者抑制了抗原逃逸的减少和肿瘤清除率的提高[25]。同时已经开发了同时表达多种CAR构建体的CAR T细胞。同样，另一项研究发现，在自体小鼠模型中，针对三种不同胶质母细胞瘤靶标的三价CAR T细胞在不同患者之间出现抗原异质性，并促进了肿瘤清除[26]。在肿瘤环境中靶向突变抗原或非肿瘤细胞抗原，例如成纤维细胞或肿瘤脉管系统，也可以克服抗原逃逸[27]。如一组所示，识别EGFRvIII的EGFRvIII CAR T细胞抑制了胶质母细胞瘤模型中的肿瘤生长[28]。

有限的CAR T细胞运送

从血液到肿瘤部位的成功转运是CAR T细胞攻击肿瘤细胞的先决条件。然而，有限地运送到实体瘤是另一个主要障碍。与容易获得血液恶性肿瘤不同，实体瘤中有一些因素导致T细胞归巢效率低下和肿瘤部位浸润受限。一个因素是肿瘤组织表达的趋化因子失配，通常与CART细胞上的趋化因子受体（CCR）不兼容[33]。另外，由致密细胞外基质（ECM）构成的物理屏障以及实体瘤中异常的肿瘤血管进一步抑制了浸润[12]。因此，已经提出了许多策略来克服有限的T细胞运输。局部输注将CAR T细胞递送至肿瘤部位或颅腔似乎是一种潜在的策略，也可以避免全身性注射的毒性和脱靶效应。分别评估了乳腺癌脑转移和卵巢癌的颅内给药和腹膜内CAR T细胞的输送[34-36]。然而，在广泛的肿瘤转移的情况下，这些策略是不可行的。

有必要探索增强T细胞浸润并实现精确细胞归巢的其他策略。通过直接优化CAR T细胞以表达良好匹配的CCR，CAR T细胞可以更好地与肿瘤细胞表达的趋化因子配体相互作用（图1C）。Moon等利用慢病毒载体获得表达CCR2b的抗间皮素CAR T细胞，该细胞与癌细胞分泌的趋化因子配体2（CCL2）相互作用，并在异种间皮瘤移植模型中显示出改善的T细胞浸润，并伴有改善的抗肿瘤活性[37]。最近，另一项研究发现表达CXCR2的CAR T细胞可以促进T细胞归巢并增强抗肿瘤反应[38]。另外，另外的CCR，例如CCR4也已被证明在不同程度上有效[39]。

为了增强迁移和浸润能力，另一种可能的方法包括通过设计CAR T细胞识别基质细胞相关抗原或分泌基质降解酶来破坏实体瘤中的物理屏障（图1C）。有吸引力的靶标之一似乎是蛋白酶成纤维细胞活化蛋白（FAP），它在许多实体瘤中的成纤维细胞上表达[40]。此外，在多种肿瘤模型中对FAP CAR T细胞的评估显示出有效的肿瘤抑制作用和FAP阳性基质细胞数量的减少[41]。在另一项研究中，肝素酶（HPSE）修饰的CAR T细胞旨在补充基质中的HPSE功能不全，也显示出促进基质降解和T细胞浸润的作用[42]。 

肿瘤微环境的免疫抑制

即使成功地运输了CAR T细胞，另一个主要障碍是高度免疫抑制的TME可以使它们无反应[43]。实体瘤通常以由多种免疫抑制分子和抑制性免疫细胞组成的抑制性TME为特征。抑制性免疫细胞（例如调节性T细胞）可以通过接触依赖的方法阻碍CAR T细胞的增殖和细胞毒性能力，而某些抑制性分子（例如转化生长因子-β（TGF-β）和IL-10）则可以促进T 通过间接接触引起的细胞无反应[13]。最近，已经出现了各种策略来克服免疫抑制性TME，并使其对T细胞的存活和增殖有益（图1D）。

一些研究已经致力于修饰CAR T细胞以过表达促进炎症的细胞因子，例如IL-12，IL-15和IL-18，这些细胞被称为铠装CAR T细胞[44-46]。与全身性注射刺激分子引起的毒性相反，这种方法可以安全地调节局部微环境。确认工程改造的T细胞分泌IL-12可诱导卵巢癌的增殖能力，生存能力和细胞毒性增加，以及对细胞凋亡和PD-L1诱导的功能抑制的抵抗力[47]。在白血病模型中，还发现表达IL-15的抗CD19 CAR T细胞达到持久性并诱导持续缓解，其机制可能与记忆细胞亚群的形成有关[48]。同样，在神经母细胞瘤转移模型中，用IL-15优化GD2 CAR T细胞可提高抗肿瘤能力[49]。此外，有关分泌IL-18的CAR T细胞的相关研究表明，这些细胞具有增强的增殖和浸润能力，并且可以募集内源性免疫细胞来调节TME [50，51]。

还需要考虑其他将CAR T细胞与抑制性分子隔离的策略，例如阻断CAR T细胞和TME中的免疫抑制信号（图1D）。由于TGF-β信号传导是重要的抑制途径，因此促进抗肿瘤反应的可行替代方法是阻断TGF-β信号传导。一组发现，在临床前前列腺癌模型中，TGF-β显性负性受体（DNR）可以有效地保护CAR T细胞免受免疫抑制细胞因子的干扰，从而抑制信号转导[52]。或者，用受体工程改造的CAR T细胞将TGF-β信号转化为4-1BB或IL-12刺激信号，发挥强大的抗肿瘤作用，并对免疫抑制信号产生抗性[53]。另一小组还发现，TGF-βCAR T细胞具有增强的细胞毒性和增强的抗肿瘤免疫功能，可以保护相邻的免疫细胞免受TGF-β介导的免疫抑制作用[54]。

同样，对胰腺癌模型的研究表明，表达倒置细胞因子受体的CAR T细胞可以促进T细胞存活。IL-4的细胞外部分 融合受体和IL-7受体的细胞内片段，将免疫抑制细胞因子信号转化为激活信号[55]。诱导内源性抗肿瘤免疫反应和增强共刺激信号的方法也已被探索[56]。另外，诸如营养缺乏，低pH值和低氧等代谢紊乱是TME的另一个特征，而代谢竞争进一步限制了CAR T细胞的活性[57]。改革CART细胞的代谢途径可能是另一种策略。例如，在低氧条件下，可以稳定表达转录因子低氧诱导因子1-α（HIF-1α）。通过修饰CAR T细胞表达HIF-1α，这些细胞具有抗缺氧的能力，从而导致CAR表达增加和溶瘤作用改善抗肿瘤作用[58]。

最近的研究集中在使用基因沉默技术，例如CRISPR / Cas9或短发夹RNA（shRNA），直接敲除CAR T细胞中编码抑制性受体PD-1的基因。例如，一组通过CRISPR/Cas9使抗CD19 CAR T细胞中的PD-1沉默，并在PD-L1阳性肿瘤模型中显示出挽救的T细胞活性和提高的抗肿瘤功效[61]。MSLN CAR T细胞沉默PD-1基因导致内源性PD-1水平下调，T细胞扩增增强和肿瘤细胞裂解[62]。

另外，修饰CAR T细胞以表达转换受体似乎是克服免疫检查点或抑制分子的一种有吸引力的策略，这可以将抑制信号转换为刺激信号[63]。通过将免疫抑制信号的胞外区域与激活的细胞内结构域融合来创建PD-1开关受体（图1E），并将PD-L1信号转化为刺激信号，从而抵抗T细胞功能障碍并促进肿瘤消退[64]。还已经探索了改造具有显性负PD-1受体的CAR T细胞的尝试（图1E）。由于缺乏跨膜区段和细胞内信号转导结构域，具有DNR的T细胞具有与内源性细胞受体竞争结合PD-1的能力，但不能转导抑制性信号[65]。此外，已经证明可以释放PD-1 bloking抗体的工程CAR T细胞可以增强CAR T细胞的抗肿瘤作用[66]。

创新的联合疗法

尽管血液系统恶性肿瘤的缓解率很高，但患者在CAR T细胞治疗后仍缺乏持续缓解，最终会出现疾病复发。CAR T细胞的功能与患者的临床结局密切相关，并且这些细胞在体内的激活，杀伤功能和持久性是受多种因素（例如肿瘤因素，T细胞因素和个体）影响的动态过程。因素[67]。每个方面都可能影响CAR T细胞的应用，因此仅通过单调的方法似乎不足以解决这些复杂的因素。除了直接对T细胞进行遗传修饰外，还应探索克服CAR T细胞扩增不足并增强体内持久性的替代策略[68-71]。通过直接增强T细胞的功能或通过募集内源性免疫细胞以及重塑TME，组合疫苗，生物材料和溶瘤病毒的最新进展具有实现预期结果的良好应用前景。

CAR T细胞疗法联合疫苗

通过特异性诱导T细胞攻击肿瘤，治疗性癌症疫苗已成为癌症治疗中的关键突破。一些研究发现，双特异性T细胞表达针对肿瘤的CAR和针对强免疫原（例如流感病毒）的内源性T细胞受体（TCR），它们在用免疫原疫苗免疫后显示出强大的扩增能力和抗肿瘤活性[72-75]。

疫苗接种提供了另一种策略，可进一步促进体内这些CAR T细胞的扩增，激活和细胞毒性（图1F）。一种常见的疫苗是基于病毒的疫苗：例如，基于巨细胞病毒（CMV）的疫苗与过继输注T细胞相结合可协同促进肿瘤清除[75]。在多种小鼠模型中，接种表达gp100的病毒疫苗可增强T细胞扩增和肿瘤消退[72]。一项针对B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者的最新研究还表明，即使不进行淋巴结清扫术，使用病毒疫苗刺激天然TCR也会使CD19修饰的病毒特异性T细胞得以成功扩增并增加可持续性[77] ]。但是，存在病毒重新激活和病毒血症的风险，需要进一步评估病毒疫苗的安全性。

在临床前和临床试验中，其他含有可溶性肿瘤相关抗原（TAA）和树突状细胞（DC）佐剂的癌症疫苗已显示出可激活TAA特异性效应细胞并刺激抗体产生[78]。DC是专职的APC，可调节自然和获得的免疫力，在免疫治疗过程中至关重要。一研究表明，DC疫苗在体内可增强ACT的T细胞活化，扩增和抗肿瘤作用[79]。在一项关于梅尔异常的临床试验中，在给患者接种带有肿瘤抗原的DC疫苗后，注入了浸润肿瘤的T细胞，导致一个人完全缓解，两个人病情稳定[80]。

在DC疫苗介导的CAR T细胞刺激研究中也有平行结果。一组发现由病毒特异性CTL制备的GD2 CAR T细胞在首次与神经母细胞瘤一起体外培养时杀死了靶细胞，但这些T细胞在第二次暴露后无法控制肿瘤。然而，可以通过单独使用DC或DC上清液重新激活病毒特异性TCR，并拯救CAR T细胞功能[73]。用肿瘤特异性抗原肽震惊的DC细胞疫苗接种可增强异种移植小鼠模型中细胞内癌蛋白WT1 CAR T细胞的扩增和功能，并促进肿瘤清除[81]。尽管DC疫苗可能是增强CART细胞的安全方法，但是接受癌症疫苗治疗的患者已显示出中等的抗肿瘤免疫反应，并且临床治疗效果非常有限。将来需要改进这些方法。

CAR T细胞疗法结合生物材料

直接修饰CAR T细胞表达支持因子时存在一些缺点，例如操作复杂和不可控制的全身毒性。因此，迫切需要开发新的策略，而生物材料提供了潜在的补充途径。越来越多的研究人员正在不断探索一些基于纳米医学的方法，以改善过继注入的T细胞的功能。

合成的纳米颗粒可以设计成通过化学偶联的抗体或与靶细胞表面受体结合的配体将更大的基因货物或药物引导至体内靶细胞亚群（图1F）[82]。一些研究探索了脂质体在ACT中传递刺激分子的潜力。Zhang等用细胞因子或细胞特异性抗体修饰的聚乙二醇化脂质体转移货物并模拟T细胞扩增，并观察到体内T细胞的成功标记和显着扩增[83]。最近，还开发了背包纳米颗粒以自分泌方式将支持药物与免疫细胞连接并增强细胞功能[84]。蛋白质纳米凝胶是另一种生物材料，可以携带治疗物质并根据抗原识别释放货物。李堂等应用蛋白纳米凝胶将IL-15超级激动剂转运至TME，并观察到EGFR CAR T细胞的效力显着提高，并改善了荷瘤小鼠的存活率[85]。此外，纳米颗粒已经突破了长期体外制备CAR T细胞的障碍。一组利用DNA纳米载体转移识别白血病细胞的CAR基因的研究人员发现，循环中的T细胞可以快速，准确地重新编程为原位抗原特异性T细胞，并达到相同的效果[86]。

使用负载有免疫抑制抑制剂的纳米颗粒是逆转抑制性TME的另一种有前途的方法。张等。发现封装免疫调节剂PI-3065和7DW8-5的靶向肿瘤的脂质体抑制了单核细胞衍生的抑制细胞，同时增加了内源性抗肿瘤细胞，并为CAR T细胞治疗提供了两周的窗口。在此输注期间，CAR T细胞可以有效渗透，稳健扩展并促进小鼠模型中的肿瘤清除[87]。同样，聚乙二醇化的免疫脂质体将TGF的小分子抑制剂转运至ACT细胞并在体外维持T细胞增殖[88]。

纳米颗粒还可以将抗原转运到淋巴组织，并刺激内源性APC呈递抗原，从而协助CAR T细胞疗法。马乐源等通过将CAR的小分子或肽配体连接到脂质尾巴上，实现了结合白蛋白的磷脂聚合物，以实现淋巴结靶向。结果，CAR配体被白蛋白有效地传递到淋巴结，并通过脂质尾部插入APC膜，以修饰巨噬细胞和DC，随后的内源性细胞活化进一步促进了CAR T细胞的增殖并增强了抗肿瘤作用[89]。最近，另一项研究表明，纳米RNA疫苗可以直接增强CAR T细胞的细胞毒性作用，并克服刺激不足和可持续性低的问题。这种纳米粒子疫苗可以将CAR抗原转运至淋巴组织中的APC，并同时启动Toll样受体依赖性I型干扰素驱动的免疫刺激程序[90]。

CAR T细胞疗法与溶瘤病毒的结合

作为一种选择性感染肿瘤细胞的病毒，溶瘤病毒不仅直接裂解细胞，而且还通过募集免疫细胞并释放促炎分子来诱导内源性抗肿瘤免疫。此外，溶瘤病毒也可以修饰为平台形式以运送货物[91]。因此，溶瘤病毒的联合治疗是恢复肿瘤免疫抑制和增强CAR T细胞功能的一种有前途的联合策略，尤其是使用溶瘤病毒将治疗药物或基因转运到TME [91]。

一方面，溶瘤病毒可将多种肿瘤抗原呈递给CAR T细胞，并有助于克服抗原逃逸。最近，CAR T细胞与溶瘤病毒结合 在体内研究了表达特异于EGFR的BiTEs并在克服肿瘤异质性方面显示了协同作用[92]。另一方面，编码趋化因子的转基因溶瘤病毒可以将CAR T细胞吸引到肿瘤部位并促进浸润。例如，在小鼠模型中，CAR T细胞与表达趋化因子RANTES和细胞因子IL15的溶瘤病毒的组合已显示可改善浸润并促进明显的肿瘤消退[93]。在另一种表达趋化因子CXCL11的溶瘤病毒研究中也发现了类似的令人鼓舞的结果[94]。研究还试图通过修饰溶瘤病毒以表达免疫抑制剂并促进炎症因子来克服免疫抑制。表达细胞因子IL-15，IL-2和TNF的溶瘤腺病毒已被证明可逆转免疫抑制性TME，促进CAR T细胞浸润并增强持久性[95]。另一项研究表明，将溶瘤腺病毒经颅内注射结合形成PD-L1阻断小抗体，具有改善HER2 CAR T细胞抗肿瘤功效的潜力[96]。

CAR T细胞疗法仍然是癌症治疗的潜在策略。然而，迄今为止在实体瘤的治疗中还没有取得成功。实体肿瘤带来的挑战，包括缺乏特异性肿瘤靶标，异质抗原表达，有限的浸润和抑制性TME，是阻碍CAR T细胞疗法成功的主要因素。各种精确和可控的方案是目前正在修改CAR结构。而且，临床前模型中的组合治疗策略已经成功，表明了转化为临床应用的潜力，并且将来需要更多的临床研究来评估组合疗法的效果。

~Am J Cancer Res 2020;10(7):1979-1992，

嘉宾介绍

杨红艳  Cytiva 大中华区研发总监

2006年，杨红艳女士作为资深研究员加入Cytiva前身GE医疗生命科学业务，参与在上海建立一个新的Fast Trak技术中心。很快，她被提升为Fast Trak 全球技术培训经理，负责全球针对生物制药工业领域技术培训的开发和运行。在2015年，杨红艳女士决定挑战自己，去负责GE医疗生命科学业务新收购一个业务的整合和发展。在两年里，连续实现该业务的年增长率在30%。她于2017年又重新加入Fast Trak技术中心，带领整个技术团队在大中华区为生物制药企业提供技术培训，工艺开发和桥接生产服务。目前，她和她的团队每年为来自生物制药领域300以上的人员提供技术培训，并且为10多个项目提供新药开发和临床试验申报和临床I期样品生产。

李玉玲博士  浙江健新原力CEO

李玉玲博士是浙江健新原力制药有限公司（Innoforce）的共同创始人和首席执行官。健新原力位于中国杭州，目前的重点是建设全方位的创新药物工艺开发和包括单克隆抗体、质粒DNA、病毒载体和细胞治疗产品的国际标准生产基地。她还担任过冠科美博(Apollomics)公司工艺开发和制造高级副总裁, AstraZeneca 旗下美国生物制药公司MedImmune的Fellow和科技总监, Human Genome Sciences Inc. (HGS，美国人类基因科学公司）的资深总监。并在Hoffmann-La Roche Inc. (罗氏药业) 公司任职多年。

李玉玲博士对生物制药开发和GMP生产的具体管理、对生产机构的设计基础以及研究和开发管理有广泛的实际经验，并参加了多个生物制药生产基地包括两万升单克隆抗体生产线的设计。她参与了三十多个生物药物的研发, 包括单克隆抗体以及许多重组蛋白产品和小分子药, 并带动4个BLA/MAA的申报和3个生物药的成功报批(Belimumab,Raxibacumab, Brodalumab)。李博士熟悉从研发到进入临床一期到三期的工艺开发, CMC 功能管理, 以及之后对报批和进行商业化的各阶段的准备。

李玉玲博士在2014年获得了医疗保健女企业家协会新星奖。她是美国华人生物医药科技协会（CBA）2007-2008 的会长, 董事会和顾问董事会的成员, 及BayHelix会员。李博士还是美华生物医药联盟 (All-CABPA) 的共同发起人和创任会长之一，该联盟于2008年5月成立。

Vidya Murthy博士  Cytiva全球病毒载体和基因治疗解决方案高级市场经理

Vidya Murthy 博士是Cytiva基因治疗解决方案市场负责人，拥有 15 年以上的学术和行业经验。之前她是一位神经科学家，在基因治疗、分子生物学、抗体合成、蛋白纯化等应用领域均具有专业知识。进入Cytiva后在产品管理、产品营销和管理项目方面表现出众。她通过持续的内外合作，推动Cytiva在基因治疗领域的整体解决方案发展。

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