一种新型抗体替代品——亲和体的研究进展

作为抗体的一种新型替代品，亲和体不仅以高亲和力与靶蛋白特异性结合，同时又具备相对分子质量小（~6 500）、穿透性强、免疫原性弱和制备过程简单等诸多特性。因此，亲和体在肿瘤靶向治疗、体内成像诊断和生物技术应用等方面具有更突出的优势和可行性。此文对其特性和应用研究进展做一综述。

亲和体是葡萄球菌蛋白A（staphylococcal protein A，SpA）经改造而获得的一类由58个氨基酸组成的小分子蛋白，其结构域为3个α螺旋^[1]（图1）。将SpA中与IgG Fc段非特异性结合的B结构域改造获得空间构型稳定的Z结构域；以其为基础，将第1和第2个α螺旋表面的13个特定氨基酸进行随机突变，通过噬菌体展示构建突变文库，进一步用靶蛋白进行亲和筛选，可获得与该靶蛋白有高度亲和力的特异性结合分子^[2]，称为亲和体。目前，有超过500篇文献报道了针对50多种靶蛋白，如人表皮生长因子受体（human epidermal growth factor receptor，HER）2、HER3、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、TNF、HPV E6/E7和EB病毒潜伏膜蛋白（Epstein-Barr virus latent membrane protein，EBV LMP）等的亲和体^[3-9]。

亲和体相对分子质量为6 500~7 000，仅为常规抗体的1/20、单域抗体（single domain antibody, sdAb）的1/2。由于相对分子质量小，因此其渗透性和组织穿透力强，在实体瘤等致密组织中易渗透组织间隙与细胞表面或者胞内靶蛋白特异性结合；血液中未被结合的亲和体可快速通过肾小球过滤排出体外，以荧光/放射性同位素标记的亲和体作为示踪剂用于体内成像诊断时背景更低；此外，亲和体免疫原性较弱，刺激机体产生免疫应答的几率较低。

单克隆抗体（单抗）稳定性较弱，易发生聚集并出现不可逆的热聚合现象^[10]。亲和体中的亲水性和疏水性氨基酸分布较为均匀，与单抗及sdAb不同，亲和体不含半胱氨酸，其折叠不依赖二硫键。在偶联放射性同位素（如^99mTc或^186/188Re）等成像标记物时，使用氧化剂或还原剂无需考虑蛋白变性的风险^[11]。同时，亲和体耐热（高至90~95 ℃）^[12-13]和耐酸碱（pH3.6~11.0）^[12-14]能力较强，用大环螯合剂快速标记时不影响其结合特异性和亲和力。

亲和体结构简单，通过多肽合成或原核表达系统即可高效表达获得。重组亲和体在原核表达系统内以可溶性形式大量表达，无需变性复性即可获得具有天然构象和功能的特异性结合分子^[1]，故亲和体制备成本相对较低，可大规模生产用于开发治疗性抗体替代药物、诊断试剂及用于科学研究等领域。研究发现，不同亲和体由于序列差异，表达产量的差异也较大。与亲和体相比，具有复杂天然构象及糖基化修饰等的单抗必须采用杂交瘤细胞筛选制备，制备过程复杂，成本较高。

常规抗体含多个结构域，Fab段结合抗原后抗体构象改变，可激活补体及引起如调理吞噬、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）等Fc段的免疫效应，从而导致非预期的免疫毒副反应。与单抗相比，亲和体分子的结构非常简单，仅有3个α螺旋无Fc段结构域，从而避免了Fc段的生物学效应。

亲和体通常是经过基因工程的方法从单克隆噬菌体中克隆出完整基因，再利用原核细胞进行表达获得。因此，对现有的亲和体进行修饰或对相应的编码基因进行改造较为容易。亲和体单体是理想的多价和多特异性亲和体的构建单元，可通过柔性肽序列接头连接聚合在一起构成多价或多特异性的形式^[15-17]。多价亲和体比单价亲和体具有更高的亲和力，多特异性亲和体比亲和体单体具有更强的抗原识别能力。还可将亲和体作为导向分子与其他分子，如放射性同位素、荧光素和抗肿瘤药物等直接偶联；或通过基因工程技术与其他基团，如能延长半衰期的人血清白蛋白和可制备成免疫毒素的毒素分子等连接形成新的融合分子^[9, 18-20]。

利用常规抗体成像必须根据其生物半衰期选择合适的放射性核素（如⁸⁹Zr，半衰期为3.27 d；⁶⁴Cu，半衰期为12.7 h）偶联，注射此类单抗示踪剂后需要4~5 d才能得到对比度和灵敏度均符合临床要求的高质量图片^[21-23]，且长时间的血液潴留增加了患者的辐射剂量。亲和体具有相对分子质量小、组织穿透力强、易通过肾脏排出体外和理化性质稳定等特点，故用放射性同位素和近红外荧光素标记后的亲和体作为示踪剂在正电子发射断层显像术（positron emission computed tomography，PET）、单光子发射计算机断层成像术（single-photon emission computed tomography，SPECT）及免疫PET等影像学诊断应用中具极大优势。小鼠肿瘤模型研究证实，HER2特异性亲和体较单抗及单链Fv具有更高效的组织穿透力，在静脉给药后1 h即可到达肿瘤病灶成像^[24]。临床应用表明，在HER2⁺乳腺癌患者体内注射短半衰期放射性核素（如⁶⁸Ga，半衰期为68 min；¹⁸F，半衰期为110 min）标记的HER2亲和体后数小时，即可获得高对比度的SPECT和PET图像^[25-27]。重要的是，HER2亲和体与靶蛋白的结合位点不同于曲妥珠和帕托珠单抗，即亲和体与单抗不会竞争结合^[28]。患者在进行单抗靶向治疗过程中使用HER2亲和体，既不影响亲和体对HER2的分子成像，也不会干扰单抗的疗效。因此，亲和体在肿瘤的早期诊断、转移和复发病灶的成像方面具有明显的优势。

2.2.1  封闭/阻断靶蛋白生物活性    基于单抗阻断作用的分子靶向治疗/免疫治疗，如针对免疫细胞免疫检查点细胞毒性T淋巴细胞抗原4、程序性死亡蛋白-1、自然杀伤细胞表面抑制性受体NKG2A等抑制性分子的抗体，由于Fc段结构域可激活补体及引发ADCC等毒副效应，故开发研究时需综合考虑^[29-31]。与不含Fc结构域的抗体片段单链抗体、Fab、纳米抗体一样，亲和体以其高亲和力特异性在阻断/封闭靶蛋白效应中发挥重要作用。研究发现，针对阿尔茨海默病β淀粉样（amyloid β, Aβ）肽的亲和体可形成二聚体来阻断Aβ肽的聚集，进而抑制淀粉纤维化^[32]；针对TNF-ɑ的亲和体可与结肠炎患者体内的TNF结合阻断其下游信号，进而缓解患者症状^[6]；HER3亲和体与HER3特异性结合可阻断其与天然配体调蛋白的结合，从而阻断下游的PI3K-Akt和Ras-MAPK等通路，抑制肿瘤细胞生长^[33-34]；HER2特异性亲和体可通过下调HER2的磷酸化进而抑制其功能，抑制肿瘤细胞增殖和迁移^[35]。

细胞因子IL-17在银屑病、强直性脊柱炎等自身免疫性疾病的发生发展中发挥重要作用^[36]。Izokibep（又称IMG-020/ABY-035）是一种对IL-17和血清白蛋白具有高度亲和力的双特异性亲和体融合蛋白，相对分子质量仅为普通抗体的1/8，亲和力却高出一般抗IL-17抗体药物的1 000倍，而血清白蛋白特异性亲和体的融合极大地延长了药物的半衰期，且在大肠埃希菌中生产的单剂量成本仅为普通抗体的1/20左右。Izokibep已在德国成功完成银屑病的临床Ⅱ期试验，针对斑块型银屑病和银屑病性关节炎的临床试验（NCT04713072）数据表明，Izokibep对治疗包括强直性脊柱炎的多种疾病具有极大潜力。研究发现亲和体与靶蛋白结合的结构域不同于单抗^[35]，提示亲和体不仅可辅助单抗进行靶向治疗，而且在患者对单抗耐药的情况下，可以继续发挥特异性靶向肿瘤的治疗作用。上述结果表明，亲和体可通过封闭或阻断靶分子的生物活性进发挥治疗作用。

2.2.2  作为分子靶向治疗载体    除作为配体阻断/封闭靶点分子的生物作用外，针对肿瘤特异性表达分子的亲和体可为杀伤肿瘤细胞提供靶向作用，如融合细菌毒素、药物、螯合治疗放射性核素等，可发挥对肿瘤细胞的靶向杀伤作用^{[9, 19-20, 37-38]}。经截短改造的铜绿假单胞菌外毒素PE38是经美国FDA批准可用于肿瘤治疗的生物毒素。Zielinski等^[19]将PE38通过基因融合的方式构建至HER2亲和体末端制备成亲和体-毒素融合蛋白（即免疫毒素），结果显示毒素的融入并不影响亲和体对靶蛋白的亲和力和特异性，注射荷瘤裸鼠后能显著抑制HER2⁺肿瘤细胞的生长而未观察到明显的毒副作用。随后，本课题组将该毒素分子分别构建至HPV16 E7亲和体和EBV LMP2亲和体的末端，荷瘤裸鼠体内实验也发现这些融合蛋白能有效抑制HPV16⁺宫颈癌细胞和EBV⁺鼻咽癌细胞的生长^[9, 20]。但免疫原性是目前免疫毒素存在的最大问题，多次注射可能刺激机体产生抗体从而影响疗效。

为避免毒素免疫原性的问题，有学者模拟抗体药物偶联物的制备原理，将细胞毒性药物澳瑞他汀、美登素等偶联至HER2亲和体，体外细胞实验证实此分子对HER2高表达细胞株有较强的细胞毒性^[39-41]。亲和体药物偶联物体积更小，易穿透肿瘤组织。还有学者将治疗性核素¹⁸⁸Re、¹³¹I偶联至HER2亲和体，体内实验显示肿瘤组织吸收了较高剂量的核素，而肾脏和骨髓中核素的吸收剂量均未超标准^{[37-38, 42]}。上述结果表明，亲和体可作为导向载体携带毒素、药物或放射性核素用于肿瘤的分子靶向治疗。

亲和体具有与靶蛋白结合的高度亲和力，且结构稳定，因此可用于目的蛋白的检测、分离和纯化等，用途极为广泛。瑞典Affibody公司研发的针对HER2、EGFR、IgG等的亲和体已在美国Abcam公司出售，用于ELISA、流式细胞术、免疫组织化学和免疫荧光等检测技术。本实验室筛选的针对沙眼衣原体主要外膜蛋白的亲和体，可用于蛋白印迹法、免疫沉淀和免疫荧光等实验技术^[43]。进一步研究发现，小分子亲和体能穿过细胞膜进入活的靶细胞内，特异性识别并结合位于胞浆内的靶蛋白，不仅可用于追踪靶蛋白的转位和定位^[7, 43]，且可抑制胞浆内靶蛋白介导的信号通路^[7]，为基于亲和体阻断/抑制胞浆内靶蛋白的靶向治疗提供了实验依据。

作为抗体的一种新型替代品，亲和体不仅以高亲和力与靶蛋白特异性结合；同时又具备相对分子质量小（~6 500）、穿透性强、免疫原性弱和制备过程简单等诸多特性。因此，亲和体在肿瘤靶向治疗、体内成像诊断和生物技术应用等方面具更突出的优势和可行性。

不同的用途对亲和体有不同的要求，如用于体内成像诊断时，需要携带放射性核素或荧光素的示踪剂在短时间内形成高质量图像，并在短时间内排出体外；用于肿瘤靶向治疗时，则要求携带毒素、药物或核素的亲和体分子在体内的滞留时间长，以增加肿瘤组织对该分子的摄取率进而增强疗效；通过封闭/阻断分子活性用于治疗自身免疫病等时，同样要求延长亲和体在体内的滞留时间保证疗效。故后续研究则需要根据不同的目的，对亲和体做进一步的开发和改造，以便最大程度发挥其独特的功能。

杨佳   周璐琪   张丽芳   朱珊丽

温州医科大学基础医学院微生物学与免疫学教研室，温州  325000

通信作者：朱珊丽，

Email：wenzhouzsl@126.com

引用本文：杨佳, 周璐琪, 张丽芳, 等. 一种新型抗体替代品——亲和体的研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2022, 45(5): 272-276.  

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20211227-00091