Neuron | 岳丽霞团队揭示TRPM2-突触外NMDA受体偶联加重缺血性卒中时脑损伤

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关键词：揭示

资讯来源：BioArt

发布时间： 2022-04-15

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缺血性脑卒中是人群中死亡与残疾的一个重要原因【1】。许多因素共同促进了脑缺血时的神经元损伤，其中NMDA受体（NMDAR）介导的钙超载尤为突出【2】。另外，NMDAR亦激活细胞内死亡相关事件，包括活性氧生成、线粒体应激以及凋亡/坏死相关信号通路，最终诱导神经元的死亡【3】。自50年前NMDAR所介导的兴奋性毒性被发现以来，大量NMDAR拮抗剂被应用于缺血性脑卒中相关的临床试验中。但遗憾的是，这些NMDAR拮抗剂无一例外地均无法减轻患者的脑损伤或改善临床症状【4】。这一系列的失败逐渐将研究人员的注意力转向进一步探明NMDAR所介导的脑损伤的分子机制。

NMDAR为四聚体，其主要亚基包括GluN1a, GluN2a-d和GluN3a-b。NMDAR四聚体中有2个亚基为GluN1a，而另外两个亚基可以是GluN2a-d和GluN3a-b中任两个的组合【5】。在这些亚基中，GluN1a，GluN2a以及GluN2b在脑内的含量最为丰富。在缺血性卒中时，GluN2a被认为促进神经元存活，而GluN2b则被认为诱导神经元死亡【5】。另外，NMDAR对神经元的影响也与其在细胞上的分布位置有关。NMDAR虽然是神经递质谷氨酸的受体，但是超过三分之一的NMDAR并不分布在突出后膜上【6】。突触内NMDAR促进神经元存活，而突触外NMDAR则加重神经元损伤【7】。这些新的分子机制的发现解释了NMDAR拮抗剂失败的原因：它们无法选择性抑制GluN2b或突触外NMDAR。

TRPM2是一个非选择性阳离子通道。它可以被热刺激以及细胞内钙离子、ADP-核糖（ADPR）所激活【8-10】。在所有的组织中，脑组织中的TRPM2表达量最为丰富【11】。在氧化应激时，细胞内钙离子及ADPR的浓度会迅速升高并激活TRPM2。因此，TRPM2被认为是细胞的氧化应激感受器。细胞氧化应激是缺血性卒中时的标志性事件之一【12,13】。另外，TRPM2也被发现加重缺血性脑损伤【12,13】，但是TRPM2促进脑损伤的分子机制仍然不清楚。

2022年4月13日，康涅狄格大学医学院岳丽霞团队（第一作者为宗鹏宇）在Neuron上发表了文章Functional coupling of TRPM2 and extrasynaptic NMDARs exacerbates excitotoxicity in ischemic brain injury，揭示了神经元上表达的TRPM2在NMDAR所介导的兴奋性毒性中发挥着重要的作用。

研究人员通过Nestin-cre选择性地敲除了神经元中的TRPM2，并发现其能有效减少小鼠卒中模型后的脑损伤。最为重要的是，神经元特异性敲除产生的保护效果程度类似于全细胞非选择性TRPM2敲除，提示神经元上的TRPM2在TRPM2所加重的缺血性脑损伤中扮演着关键性的角色。在细胞水平，研究人员亦发现TRPM2的敲除能够抑制缺氧所诱导的神经元钙超载、线粒体应激及死亡。通过免疫共沉淀试验，发现TRPM2能够与NMDAR中的GluN2a和GluN2b相结合（物理性偶联）。另外，TRPM2与NMDAR的共表达能够增强NMDAR的激活（功能性偶联）。进一步的分子克隆实验证明了TRPM2的氨基端结构域中的EE₃模体与GluN2a/b的羧基端结构域中的KKR模体直接结合，并且通过位点突变/删除实验证明了这一TRPM2与NMDAR的功能性偶联依赖于它们的物理性偶联。

通过探明的TRPM2-NMDAR间的分子结合机制，研究人员针对性地合成了能够特异性打断这一结合的干扰性小肽。研究人员人工合成了EE₃模体并且载体TAT小肽使其能够穿透细胞膜进入细胞内（TAT- EE₃）。进入细胞内的TAT- EE₃能够占据NMDAR上的TRPM2结合位点。因TAT- EE₃的浓度极大地高于内源性TRPM2的表达量，TRPM2与NMDAR的结合将被竞争性抑制。通过免疫共沉淀实验证明了TAT- EE₃对TRPM2-NMDAR结合的抑制作用。亦发现TRPM2能够与蛋白激酶C-γ（PKC- γ）结合。PKC- γ 是调节NMDAR功能的关键性分子之一：它能够直接激活NMDAR，也能够促进NMDAR的细胞表面转运及表达。研究人员发现PKC- γ 激活剂能够进一步放大TRPM2对NMDAR激活的增强效应，而PKC- γ 抑制剂则明显抑制TRPM2所诱导的NMDAR激活增强。TAT- EE₃能够完全消除TRPM2对NMDAR激活的增强效应，证明PKC- γ对NMDAR的激活依赖于PKC- γ与TRPM2的结合。这一发现部分解释了TRPM2增强NMDAR激活的分子机制。

本研究中最重要的发现是干扰性小肽TAT- EE₃对缺氧性神经元死亡及小鼠缺血性卒中模型的保护作用。研究人员发现，在细胞水平，TAT- EE₃能够抑制缺氧所诱导的神经元钙超载、线粒体应激及死亡；在动物水平，TAT- EE₃显著降低小鼠缺血性卒中模型后的脑损伤面积并改善其脑功能损失。另外，还发现TRPM2在突触后膜的表达量极低，提示TRPM2主要表达于突触外。这表明通过TAT- EE₃所抑制的TRPM2介导的的NMDAR激活主要抑制突出外NMDAR所引起的神经元损伤及死亡，而不会损害突触后膜上NMDAR的促神经元存活作用。

总之，这一发现揭示了缺血性脑卒中时加重NMDAR兴奋性毒性的的一条重要分子机制。并且，该研究所开发的干扰性小肽TAT- EE₃具有极富前景的临床应用价值，这为缺血性脑卒中的临床治疗提供了一条全新的策略。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.03.021

制版人：十一

参考文献

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