细数一下两款FDA批准的血液cfDNA NGS panel在临床应用中发现的问题

随着用于分析细胞游离DNA（cfDNA）的NGS大panel的出现，液体活检成为了组织活检替代方法，在降低侵入性、靶向基因数量、灵敏度以及检测指标的多样性（单核苷酸变异（SNV）、融合、拷贝数变异（CNV）、肿瘤突变负荷（TMB）、微卫星状态）方面具有吸引力。尽管组织分子检测仍然是金标准，但液体活检有一个主要优势：能够揭示肿瘤异质性，反映原发肿瘤及转移灶的全貌。此外，在组织活检不可行或失败的情况下，或者当DNA的质量和数量（例如，肿瘤细胞含量不足或样本存放太久）影响测序时，液体活检可以克服组织活检的采样限制。液体活检可以应用于这些场景：辅助诊断、预测患者预后或对治疗的反应、疗效监测、耐药监测，以及跟踪肿瘤演变。

基于cfDNA的全面基因组测序项目自从获得FDA批准，已得到越来越多的应用，检测结果通常由分子肿瘤专家委员会（MTB）讨论。MTB会讨论患者选择标准，各中心的标准不同。根据我们的经验，仅讨论晚期实体瘤患者。应用最多的场景是寻找分子治疗靶点或耐药机制，以获得治疗选择以及入组临床试验的可能性。目前，许多临床试验纳入了cfDNA分析。例如，III期SOLAR-1试验评估了阿培利司+氟维司群vs氟维司群在PIK3CA突变、激素受体阳性的晚期乳腺癌患者中的疗效，血浆中检测到PIK3CA基因突变可能与疾病负荷较高、阿培利司+氟维司群联合治疗疗效更好相关。其他研究，如篮子试验GOZILA试验，基于cfDNA纳入了晚期恶性实体瘤患者，与组织检测相比，缩短了筛选时间，提高了试验入组率。此外，一些项目，如循环游离基因组图谱研究（CCGA），旨在使用深度cfDNA测序进行癌症早筛。

然而，检测基因数量的增加，以及基于NGS的cfDNA检测下限（LoD，即最低丰度的靶向变异检出率达到95%）很低，带来了分子领域新发现，例如克隆性造血（CH）相关突变或偶然发现可能加大临床决策难度的胚系变异。这篇综述的重点是目前获得FDA批准的两款cfDNA NGS panel，讨论了检测价值，以及MTB背景下相关问题。

有许多可及的泛癌种商用液体活检panel，但到目前为止，只有Guardant360®CDx（G360，Guardant Health）和FoundationOne®liquid CDx（F1LCDx，Foundation Medicine）获得FDA批准。这两款panel往往用于临床试验，要求最佳全血量为17至20 mL不等，都可以在短周转时间（7至14天）内检测SNV、CNV、融合和微卫星不稳定性（表1）。

表1. 两款FDA批准的cfDNA NGS panel间的比较

一项泛癌钟研究使用F1LCDx检测血浆样本中的激酶融合，88%的血浆样本可检出cfDNA，82.2%的样本至少检出一个基因变异，平均3.3个突变/例。

肿瘤分数是对来源于肿瘤细胞的cfDNA的估计。只有F1LCDx临床报告解读提供这一项。肿瘤分数是基于基因组标准化覆盖水平来估计的，代表了肿瘤非整倍体。

如果肿瘤来源的cfDNA比例较低，根据体细胞突变丰度（除去常见和罕见胚系变异）来估计肿瘤分数。低肿瘤分数是样本不合格的主要原因，影响组织和液体活检SNV、TMB、微卫星不稳定性、CNV和融合检测结果的一致性。在没有检出相关肿瘤变异的情况下，提取的cfDNA中是否存在肿瘤DNA不明确，通常需要分析另一个样本。而较高的肿瘤分数反映了较高的cfDNA含量，检出变异可信度更高。

尽管有许多提议和标准化项目，但组织和血液TMB（bTMB）的计算和解读都没有标准化。目前，只有F1LCDx bTMB检测获得FDA批准。bTMB根据所有丰度高于0.5%且未在dbSNP和ExAC数据库中报告为潜在胚系多态性或经典致癌驱动突变的非同义和同义突变来计算。用这些过滤后的突变数除以测序的碱基数：0.75 Mb。然后，结果表示为突变数/Mb。

由于这些cfDNA基因检测的LoD很低，存在高估bTMB的主要风险。事实上，bTMB可以比组织TMB高2.4倍，两个值之间具有正线性相关性（r²=0.62）。有趣的是，在一项免疫治疗研究中，TMB值不一致（高bTMB和低组织TMB）的患者比TMB值一致（高bTMB和高组织TMB）的患者更晚表现出治疗失败（227天 vs. 183天）。另一项研究中，观察到阿替利珠单抗为肺癌患者带来无进展生存期获益，确定了bTMB阈值为16个突变/Mb。据报道，血液和组织TMB呈正相关（spearman等级相关=0.64）。该研究中，组织TMB的阈值为10个突变/Mb。

两款FDA批准的panel均分析微卫星状态。F1LCDx分析集中在约2000个包含至少5个单核苷酸、二核苷酸或三核苷酸重复单元的重复位点。如果超过0.5%的分析位点不稳定，则该样本被视为MSI-H。而G360集中在99个包含长度为7或以上的短串联重复序列的微卫星位点。

关于泛癌种G360与组织MSI测定一致性，MSI-H患者约为87%（71/82，95% CI，77-93%），MSS患者约为99.5%（863/867，95%CI，98.7-99.8%），总体准确性为98.4%（934/949，95% CI，97.3-99.1%）。详细比较cfDNA 与不同组织技术MSI测定的一致性，与免疫组化（IHC）的一致性为83%（93/112），聚合酶链反应（PCR）为97.4%（450/462），NGS为98%（239/244）。然而，即使在大多数情况下，一致性似乎很高；在肿瘤分数低（低于0.2%）的情况下，不一致的可能性更大。

两款FDA批准的panel分析的基因数不同（F1LCDx：311个基因vs G360：73个基因）（图1）。尽管如此，71个共同基因目前足以覆盖实体瘤主要治疗靶点。

图1. 两款FDA批准的panel分析基因和两个常用参考基因列表中SNV重叠的Venn图

两家公司都使用分子标签技术来发现低丰度突变。最近的一项研究比较了12名NSCLC或胆管胰腺癌患者使用或不使用分子条形码的cfDNA NGS检测结果。不使用分子标签时，识别了7个突变；使用该技术时，识别了17个突变。分子标签的使用提高了灵敏度。使用类似的技术，如果VAF（变异丰度）在0.40-0.82%之间，F1LCDx能够在95%的样本中检测到突变。G360情况类似，VAF在0.20-0.25%之间的突变检出率为95%。

关于血液和配对肿瘤组织各种突变检测结果一致性的数据很多。在结直肠癌中KRAS突变一致性在86.4%和92%之间，转移性乳腺癌中ESR1突变一致性为74.3%，NSCLC中可用药EGFR突变一致性为79%。然而，最近一项纳入了100名肺腺癌患者（71份样本于诊断时采集，29份样本于进展后）的研究一致性较低，78个突变中，只有47.4%组织和血浆NGS均检出，5.1%仅血浆NGS检出，47.4%仅组织NGS检出。组织NGS的准确性为96%，灵敏度为94.9%，而血浆NGS准确性为63%，灵敏度为52.6%。

必须结合肿瘤分数分析这些结果。在最近的一项研究中，当cfDNA分数<1.5%时，TP53突变总体一致性为59.5%（47/79个突变），而当肿瘤分数≥1.5%时，则达到86.3%（69/80个突变）（p<0.001）。

基于cfDNA NGS能够检测到VAF低至0.1%的突变，但并非所有SNV或SNV类型。这就是为什么一些专家指出不同检测一致性有限。使用G360和另一个CLIA认证项目对转移性前列腺患者同一时间采集的40份配对血浆样本进行了检测，结果不一。只有7.5%完全一致，15%部分一致，40%完全不一致。此外，VAF非常低的SNV要谨慎考虑，应结合疾病史，并在需要时通过额外的cfDNA检测进行验证。尽可能进行组织检测，或使用比血浆更合适的体液。

两款FDA批准的panel都能够检测部分基因扩增（F1LCDx：310/324个基因，G360：18/73个基因）。只有F1LCDx报告纯合缺失，这一点很重要，尤其是涉及到抑癌基因时。很多证据表明了使用cfDNA进行拷贝数分析的可能性。尽管如此，CNV只是定性参数，不显示拷贝数（或比率），不区分真正的基因扩增或多克隆。

在神经母细胞瘤中，使用OncoScan阵列（Affymetrix）进行cfDNA基因检测，与使用阵列比较基因组杂交（aCGH）进行组织样本检测的总体一致性为97%（47/48）。

G360 cfDNA NGS与配对肿瘤组织荧光原位杂交（FISH）或IHC的HER2拷贝数变异检测结果一致性也较高。75名转移性结直肠癌患者基因检测结果显示，NGS和FISH/IHC之间的阳性符合率为82%，阴性符合率为83%，总体符合率为83%。7名患者组织样本检出HER2扩增而cfDNA未检出，其cfDNA分数明显低于其他患者，6名患者cfDNA样本检出HER2扩增而组织未检出。这些患者的组织样本是在抗EGFR治疗开始前采集的，而cfDNA样本是在疾病进展后采集的，这可以解释这种不一致性。

两款FDA批准的panel都可以检测较低丰度（0.2-0.9%）的重排和融合。使用F1LCDx，组织和血浆激酶融合检测的阳性符合率（PPA）接近70%（cfDNA：96个融合，组织：137个融合）。肿瘤分数影响融合检测的一致性，一致情况下的中位cfDNA分数为2.2%，而不一致情况下为0.37%（p<0.001）。当cfDNA分数为≥1%时，PPA达到85%。

两款FDA批准的panel都使用DNA作为融合检测的起始材料。虽然从血浆样本中提取的DNA通常质量较高，但存在几个缺点。例如，检测大内含子区域（大于25kb）的基因重排可能具有挑战性，尤其是使用基于捕获的方法。当断点不常见，或者融合伴侣未知时，可能具有挑战性。此外，另一个挑战是识别的DNA重排与其RNA表达之间的不一致。一项研究中，泛癌种队列检出了23个NTRK重排，使用基于RNA的NGS以及pan-TRK IHC进行验证，其中有两个两种方法均未检出，符合旁观者重排。

出于这些原因，ESMO推荐使用基于RNA的方法检测NTRK1/2/3或RET融合，以确认预测的融合转录物。一项大型研究证明了该推荐的合理性。该研究纳入了254例DNA-seq显示驱动基因阴性（无热点突变、扩增或重排）肺腺癌患者，对这些患者进行RNA-seq，13%的患者检出具有临床意义的变异（激酶融合或MET外显子14跳跃）。

进行cfDNA NGS大panel检测可以在早期发现治疗耐药机制。例如，没有RAS/RAF通路经典突变的晚期结直肠癌患者，可以进行化疗联合EGFR单抗治疗。在一些病例报告中，患者经过12个周期的FOLFOX+帕尼单抗以及5-氟尿嘧啶+帕尼单抗维持治疗后，出现了几个耐药突变。NGS检出的许多突变是MAPK通路热点脱靶耐药突变，包括KRAS p.（Gly12Ala）、KRAS p.（Gly12Cys）、KRAS p.（Gly12Arg）、KRAS p.（Gly12Val）、NRAS p.（Asn61Leu）。还发现了EGFR基因非经典在靶耐药突变，包括EGFR p.（Gly465Arg）、EGFR p.（Ser464Leu）、EGFRp.（Gly 465Glu）、EGFR.p.（Val441Asp）、EGFR p.（Val441Gly）、EGFR p.（Lys489Glu）、 EGFR p.（Ile491Arg）、 EGFR p.（Ser464Lys）、 EGFR p.（Ser464Phe）、 EGFR p.（Ile491Lys）。所有突变丰度均很低（0.36%-4.70%）。

另一个例子是使用液体活检检测高级别卵巢癌中乳腺癌易感基因（BRCA1和BRCA2）逆转突变，以筛选PARP抑制剂获益患者。一项研究纳入了高级别卵巢癌患者接受一线铂治疗，存在BRCA逆转突变的患者相比无逆转突变的患者无进展生存期显著更短（中位1.8个月vs.9.0个月；HR，0.12；p<0.0001）。

此外，液体活检可以反映肿瘤内异质性——出现耐药的重要因素。在大多数情况下，耐药机制不是由单个事件决定的，而是由复杂的多个变化决定的。液体活检具有吸引力，可以克服组织活检的样本限制，展现亚克隆耐药机制全貌。一项研究中，46名胃肠道肿瘤患者出现了获得性耐药机制，通过NGS液体活检，76%（32/42）的患者检出分子变异，其中53%（17/32）的患者不止一种机制，反映了与获得性耐药相关的重要肿瘤异质性。队列中23名患者在进展时同时进行了一次组织和一次液体活检，在检测耐药机制方面，cfDNA NGS比组织NGS更灵敏。87%（20/23）的血浆样本检出变异，而只有48%（11/23）的组织样本检出变异，91%（21/23）的患者为单一事件。该队列中，血浆样本中只有一个耐药突变由于丰度较低未检出。总体而言，78%（18/23）的患者液体活检揭示了组织活检未发现的耐药机制。

最后，进行cfDNA检测以寻找耐药原因时，同时检测SNV、CNV和融合很重要。例如，AURA3研究中，83名患者使用G360进行了cfDNA检测，发现奥希替尼耐药机制存在异质性，如EGFR、MET、HER2突变、PIK3CA或FGFR3扩增、RET和NTRK致癌融合。这种基于cfDNA的大panel适用于异质性耐药检测。

基于cfDNA的检测也经常导致胚系变异被发现，其中一小部分是致病性的，需要进行遗传咨询。丰度在40%到60%之间的变异可能为胚系变异，一些患者需要进行基因检测和遗传咨询。使用G360 panel的一些泛癌种研究显示，在10888个未经选择的cfDNA样本中，1.4%的样本检出胚系变异，大多数为BRCA2、BRCA1和CDKN2A变异。

然而，在肿瘤分数较高的情况下，仅通过VAF来判断是否为胚系变异不一定准确。一项研究表明，在160个液体活检显示丰度为40%-60%的变异中，只有69%配对样本胚系检测证实为胚系变异。在该研究中，96.3%的BRCA2、90.9%的BRCA1和86.7%的CDH1突变证实为胚系突变。而关于高频体细胞突变基因，75%的TP53和83.3%的APC突变是体细胞突变。在我们的801名泛癌种患者研究中，6%的患者cfDNA检出胚系致病性变异，其中一半是偶然发现的（Chabert A等人提交）。

由于这些原因，解读一个变异时，必须考虑检出的其他变异（甚至意义未明变异）的丰度。识别一些嵌合型变异也可能是一项挑战，例如一些VAF中等的（低于40%）TP53或BRCA2变异，需要额外的检测来明确是否为体细胞变异。为了解决胚系变异相关问题，可以使用相同panel进行全血NGS检测，去除不需要的变异，与全外显子组/基因组测序类似。

值得注意的是，血浆cfDNA NGS检测不能代替全血检测用于胚系变异检测，不是全基因覆盖和大片段重排检测最佳选择。如果怀疑胚系变异，或者有癌症家族史，应对全血样本进行全面分析。最后，需要注意，遗传咨询的方向应限于已经有患者和家系管理指南的基因，如ESMO提供的列表。

2%至17%的患者会发生同时性多原发性癌。大多数情况下，多发性恶性肿瘤是根据临床症状或影像学偶然发现来诊断的，但其中一小部分可以通过cfDNA测序分析发现。我们的团队最近报告了此类病例。第一例是一名肺癌患者，cfDNA检出TMPRSS2-ERG融合（前列腺癌特异性变异）。该患者随后接受了前列腺活检，证实为前列腺癌。第二例为胆管癌患者，NGS液体活检检出MYD88 p.（Leu265Pro）突变，90%的Waldenström巨球蛋白血症中存在此突变。骨髓活检发现成熟B细胞克隆，证实了血液学诊断。基于融合和SNV结果发现了这两种隐匿恶性肿瘤，不久的将来，cfDNA靶向甲基化检测将有助于了解组织起源。

基于cfDNA NGS结合了大panel和低LoD，可以检测到VAF低至0.1%的突变。将通常与克隆性造血（CH）相关的体细胞突变与肿瘤相关体细胞突变区分开来可能有难度，例如，NSCLC患者比低患癌风险对照组携带更多的克隆性造血变异。据报道，8800名非血液系统恶性肿瘤患者中CH突变的发生率超过25%。CH可能使临床报告解读变得复杂。

例如，尽管DNMT3A、TET2、ASXL1或JAK2等基因CH相关突变较为明确，但经典致癌驱动基因如KRAS或常见抑癌基因如TP53不太明确。KRAS突变常见于胰腺癌、结直肠癌或肺癌，cfDNA其检出率也较高。大多数情况下KRAS突变与致癌过程有关，在某些情况下，在配对外周血细胞中发现该经典热点突变，可能导致误诊为隐匿恶性肿瘤。

同源修复缺陷相关PARP抑制剂临床试验也存在限制。一些基因如ATM、BRCA1、BRCA2、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCL、PALB2、RAD51B、RAD51C、RAD51D或RAD51L受到关注，但应仔细分析cfDNA结果并谨慎解读。例如，10%的前列腺癌患者几个相关基因存在CH变异，特别是ATM。这可能导致误让患者参加临床试验。

最后，CH突变也可能使人们误以为检测结果有用，不再进行第二次检测，或得出结论：提取的cfDNA中没有驱动基因突变或耐药突变。当初始驱动基因突变已知而ctDNA未检出时，可以避免这个问题，证明cfDNA是有用的。

鉴于前面提到的液体活检的价值和局限性，肿瘤学专家在让患者进行液体活检之前，首先应该确定一个问题：什么时候采血，现在适合进行液体活检吗？这个问题似乎无关紧要，实则很关键。如果患者肿瘤负荷非常低，或治疗正产生疗效，则有可能不会检出变异。

另一个关键点是不同组织学类型和分期的肿瘤产生的cfDNA不同。例如，研究表明，小细胞肺癌、前列腺癌、子宫癌和肝细胞癌cfDNA检出率较高（分别为91.1%、87.9%、77.6%和77.1%），但甲状腺癌和肾癌的cfDNA检出率较低（分别为41.8%和56.4%）。cfDNA的检出也取决于疾病分期。在一项研究中，47%的I期疾病患者可检测到cfDNA，而II、III和IV期检出率更高（分别为55%、69%和82%）。

此外，在相同的组织学类型中，cfDNA也受转移部位影响。在517名驱动基因阳性晚期NSCLC患者队列中，分别有52%的中枢神经系统（CNS）进展患者，84%的CNS外进展患者，92%的CNS和CNS外进展患者检测到cfDNA。

在MTB背景下，用尽标准治疗方案后，cfDNA较早检出变异可带来其他治疗选择。在最近的一项研究中，MTB讨论后，28%（49/173）的患者被建议参加临床试验，接受液体活检或组织活检，或两者均进行。该研究显示，液体活检与组织活检相比，似乎更有可能检测到所有变异类型（OR 13.6，95%CI 5.5-43.2，p<0.001）。然而，尽管液体活检似乎能增加患者入组临床试验的机会，大多数药企临床试验纳入标准基于组织NGS结果。未来，随着经验的增加，可能更多临床试验会接受NGS液体活检结果。研究显示，cfDNA NGS相比组织 NGS，可以提高临床试验入组率（9.5% vs. 4.1%，p<0.0001）。

cfDNA临床报告解读可能具有挑战性，推荐采用以下标准：

● 肿瘤分数：如果panel提供这一信息，首先查看这一信息。要注意，没有过滤掉胚系突变可能会导致估值过高。如果不提供这一信息，必须仔细解读结果，讨论肿瘤含量。还可以根据该癌种常见“跟踪”变异的VAF进行评估，例如，散发性结直肠癌中的APC突变，或高级别浆液性卵巢癌中的TP53突变。

● MSI：肿瘤分数低可能会影响结果，PCR和IHC仍然是金标准，在怀疑的情况下应对组织进行这些检测。cfDNA NGS仅能够较好地筛选MMR阳性患者。

● bTMB：如果没有过滤掉胚系或CH突变，估值过高可能性较大。多克隆耐药也可能是估值过高的一个因素。我们建议将阈值提高到16个突变/Mb，来估计哪些患者将从免疫治疗中获益，结合其他变异解读，如果需要，进行组织检测确认结果。

● SNV：解读所识别的突变时需要考虑VAF和肿瘤分数。如果未检出假定的肿瘤变异，需要考虑结果是否有效，尤其是在没有肿瘤分数信息的情况下。此外，如检出的SNV VAF非常低，应通过组织检测确认。

● CNV：目前还没有关于高估拷贝数可能性的文献，根据我们的经验，在多体样本的情况下，肿瘤基因panel会高估拷贝数，需要谨慎解读报告的扩增，并使用FISH或IHC对组织进行检测来验证。

● 融合/重排：目前，FDA批准的panel使用DNA检测融合。这对于大的内含子区域，可能存在问题，不提供表达相关信息。出于这些原因，我们建议，如果需要，对组织进行基于RNA的检测来验证结果。

● 胚系突变：并非所有VAF在40%-60%间的突变都是胚系突变。解读结果时需考虑肿瘤分数和该癌种已知变异的VAF。如果怀疑胚系突变，需通过经验证的技术对全血进行检测，如果有遗传咨询的需要，MTB应包括遗传学专家。

● 隐匿恶性肿瘤：根据我们的经验，基于特定癌种存在特定高频驱动基因变异，根据液体活检结果，可能会发现其他恶性肿瘤。因此，我们建议MTB中包括肿瘤学家和血液学家。如果高度怀疑，可以向临床医生建议检查是否有第二种癌症。

● CH：需与血液学家讨论血液检出的高VAF突变的致癌可能性。如果风险较高或全血计数异常，可进行血液学咨询。此外，如果怀疑临床试验纳入标准包含的基因存在CH突变，需进行验证。

参考文献：

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