从早期研发、表征分析、工艺优化到CMC、QC 分析，生物药在每一个环节均存在着复杂性和不确定性，如何正面树立中国生物制药企业的整体“质量”形象，如何创新和质量并重，并接轨世界标准？这些都是值得讨论的课题。高分辨质谱技术的广泛应用，可以为生物药企业提供稳定准确的分析方法，为药品申报上市提供有力保障。今天我们就讨论一下有哪些前沿应用可以借鉴呢？

一.蛋白表征分析

01

一级结构分析

分子量测定

基于Orbitrap超高分辨质谱测得的分子量更接近实际值，且能够准确分辨质量相近的成分[1,2]，以更加严格的标准表征蛋白。

02

一级结构分析

肽图分析

一级结构分析—肽图分析，生物药的 氨基酸序列 是其生物活性、临床疗效的物质基础，确保序列与预期一致是首要条件。且氨基酸的翻译后修饰可能会影响其亲和力和生物学活性，鉴定修饰的类型和位置可作为生物药CQA评定的重要指标。

图1. 基于Orbitrap高分辨质谱采集的肽图分析

通过Orbitrap超高分辨质谱仪能够获得蛋白类药物更加准确的一级精确质量和丰富的二级碎片信息，为生物药的氨基酸和翻译后修饰表征提供强有力的支撑。

03

一级结构分析

糖型分析

一级结构分析—糖型分析，糖基化对生物药的疗效、稳定性、免疫原性具有重要的影响。面对结构极为复杂的寡糖，这一难题要如何解决？

方案一、游离糖型LC-MS分析完整解决方案

经典的LC-MS分析流程，释放糖链，糖链标记，荧光对糖链进行定量，高分辨质谱进行糖链结构鉴定。

方案二、游离糖型IC-MS分析完整解决方案

对于高含量的唾液酸蛋白， 2AB标记过程中会导致脱唾液酸化 [3]，而离子色谱和质谱联用的方案 无需糖型衍生化 复杂的样品前处理过程，实现对未衍生化糖型的直接定量和定性，减少样品在标记过程中唾液酸的降解。

04

高级结构分析

氢氘交换质谱法（HDX-MS）

高级结构分析—氢氘交换质谱法（HDX-MS），对样品的要求比较低，不需要结晶，溶液状态即可；对缓冲盐，辅料等干扰物质的容忍性比较高；可以保证蛋白或者蛋白复合物在天然非变性状态下进行测定；能够实现从 完整水平、局部水平以及单个氨基酸的水平 上获得详细信息，使得最终的蛋白质高级结构的信息 更加全面和准确 。

图2.氢氘交换质谱法完整解决方案（点击查看大图）

二. 生物药宿主细胞残留蛋白（HCPs）分析

HCPs的存在主要影响药物的安全性和有效性，基于Orbitrap高灵敏度和宽的动态范围，可实现对未知HCPs的高通量定性和定量。与ELISA方法相比开发周期更短，兼顾定性和定量，图3为针对极低含量HCPs的完整解决方案。

图3.基于LC-MS/MS方法对低含量的HCPs进行准确的定性和定量（点击查看大图）

三.生物药的生物分析

对于大分子的生物药而言，基于质谱定量方法相比于Ligand Binding Assays方法 具有同时定性和定量、高特异性、开发周期短的优势 ；与三重四极杆质谱相比，除具有可 媲美的定量能力外，能够监测生物药体内生物转化 的优势。针对生物药完整蛋白水平和多肽水平定量的完整解决方案如图4， 其定量限和线性范围远高于实际需求。

图4.基于LC-MS和LC-MS/MS对重组生物药生物分析的完整解决方案（点击查看大图）

四.多质量属性方法工作流程MAM

1个工作流程：

HR MAM是1个高分辨率高质量精度，实现从研发直至质量控制（QC）阶段产品质量属性的全面表征和监控的工作流程。

2个软件：

其中包含2个软件：Biopharma Finder找出关键质量属性，Chromeleon变色龙实现仪器控制及数据采集分析并具备强大的合规性。

3个要素：

3个要素：质量属性表征；质量属性监控以及未知组分检测。最终实现 一套方案能够实现多种传统分析方法检测结果 ，真正的 化繁为简 。

图5. 基于Orbitrap超高分辨质谱的多重关键质量属性（HR-MAM）完整解决方案（点击查看大图）

目前某国际创新生物制药巨头已将HR MAM用于质量控制阶段[4]，以及美国监管机构最近在AC上发表对MAM方法的评估[5]，极大推进高分辨质谱用于生物药在生产质量控制实际应用的进程。

五.总结

单抗药物是生物药中最大类别，其具备特异性强、灵敏度高、安全性高的独特优势，是全球制药领域发展主流之一。随着国内需求端及支付能力的持续提升，医保覆盖面及上市品种的持续扩大，我国单抗市场将迎来快速发展时期。在单抗开发和生产的所有阶段都需要进行表征分析，包括完整分子量测定，肽图分析，糖型分析，二硫键确证，高级结构解析等。如果你想知道更多关于表征分析的干货，请关注8月13日赛默飞举办的【单抗药物表征分析中的关键环节及案例分享】直播讲座。本讲座将针对单抗药物表征分析分享最前沿的实践经验及案例，欢迎一起探讨。

直

播

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排

 时间：2020年8月13日  19:00-21:00

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19:00-19:05 

主持人开场

19:05-19:45

单抗药物纯度分析和杂质鉴定

张磊，上海复宏汉霖生物技术股份有限公司分析总监

19:45-20:25 

色谱分析新技术助力单抗药物研发

 刘晓达博士 赛默飞液相色谱资深应用专家

20:25-21:00 

基于Orbitrap高分辨质谱对单抗药物的深度表征

陈兵 赛默飞LCMS 大分子资深应用专家

演讲专家

上海中医药大学博士毕业，14年的分析和生物药质量研究经验，先后就职于上海有机所质谱中心，Agilent（GC/LC-FTMS部门），GE （上海研发中心，AIMS部门）和三生国健药业(上海)股份有限公司，目前任上海复宏汉霖生物技术股份有限公司分析总监。专注于色谱、质谱和电泳类分析，以及生物药研发和生产不同阶段的质量研究和申报支持，特别是单抗药物的结构、纯度和杂质研究，和相应的标准制定。

军事医学科学院药物分析学专业博士，毕业后在军事医学科学院放射医学研究所和野战输血研究所工作，从事HBV和HCV肝炎病毒等血源性病原体免疫学和核酸诊断快速检测方面的研究，1999年9月晋升副研究员。多年来的研究工作涉及气相色谱、液相色谱、毛细管电泳、病原体的快速诊断等。

赛默飞LCMS 大分子资深应用专家，2016年加入赛默飞世尔科技（中国）有限公司色谱质谱事业部，主要负责样品前处理和质谱平台的管理和蛋白质组学，生物制药的应用方法开发，技术支持和科学研究工作。

参考资料：

[1]. He J, Su D, Ng C, et al.High-resolution accurate-mass mass spectrometry enabling in-depthcharacterization of in vivo biotransformations for intact antibody-drugconjugates[J]. Analytical chemistry, 2017, 89(10): 5476-5483.

[2]. Schachner L, Han G, Dillon M, et al.Characterization of chain pairing variants of bispecific IgG expressed in asingle host cell by high-resolution native and denaturing mass spectrometry[J].Analytical chemistry, 2016, 88(24): 12122-12127.

[3]. Szabo Z, Thayer J R, Reusch D, et al.High performance anion exchange and hydrophilic interaction liquidchromatography approaches for comprehensive mass spectrometry-basedcharacterization of the N-glycome of a recombinant human erythropoietin[J].Journal of proteome research, 2018, 17(4): 1559-1574

[4]. Rogers R S, Nightlinger N S, LivingstonB, et al. Development of a quantitative mass spectrometry multi-attributemethod for characterization, quality control testing and disposition ofbiologics[C]//MAbs. Taylor & Francis, 2015, 7(5): 881-890.

[5]. Rogstad S, Yan H, Wang X, et al. Multi-AttributeMethod for Quality Control of Therapeutic Proteins[J]. Analytical Chemistry,2019, 91(22): 14170-14177.