NCB | 陈佳/杨力/殷昊/杨贝联合开发高精准变形式碱基编辑系统

由定位子CRISPR/Cas与效应子胞嘧啶脱氨酶APOBEC（apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide）结合构成的胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor, CBE），可在靶向位点实现胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）的碱基转换，碱基编辑器可在多个物种中进行有效的碱基编辑，拥有巨大的临床应用潜力。根据ClinVar的统计数据显示，碱基编辑器理论上可以通过碱基转换纠正50%以上的人类致病性点突变。然而，由于sgRNA会引导碱基编辑器错误结合在与靶向位点序列相似的脱靶位点造成脱靶突变；且近期多项研究发现碱基编辑器会在全基因组和全转录组范围内引发非常严重的sgRNA非依赖性脱靶突变，并且这些突变随机分布于全基因组中。目前，仍然缺少有效预测和检测sgRNA非依赖性脱靶突变的方法，因此也极大地限制了碱基编辑系统的进一步发展及其在疾病治疗方面的运用。

2021年5月10日，上海科技大学生命科学与技术学院陈佳教授、中科院上海营养与健康研究所杨力研究员、武汉大学医学研究院殷昊教授与上海科技大学免疫化学研究所杨贝教授实验室开展合作在Nature Cell Biology上发表文章Eliminating base-editor-induced genome-wide and transcriptome-wide off-target mutations ，通过筛选鉴定首次发现部分胞嘧啶脱氨酶的调节结构域具有胞嘧啶脱氨酶抑制作用，将其定义为胞嘧啶脱氨酶抑制（deoxycytidine deaminase inhibitor, dCDI）结构域。随后利用来源于小鼠的mA3dCDI和split-TEV系统构建了一种高精准碱基编辑系统，并依据其特性命名为变形式碱基编辑系统（transformer base editors，简称tBEs）。tBE消除了现有碱基编辑技术存在的gRNA依赖性、gRNA非依赖性全基因组脱靶突变以及gRNA非依赖性全转录组水平的脱靶突变，全面解决了影响碱基编辑系统进行治疗性应用的脱靶问题。同时，tBE无需拆分即可利用双腺相关病毒（Dual-AAV）载体进行高效的体内递送，联合研究团队将tBE系统递送至成年小鼠的肝脏中，显著降低了小鼠血清中PCSK9蛋白表达水平以及总胆固醇水平，并且未在小鼠体内检测到脱靶效应。tBE同时实现了高效率、高精度以及高安全性的碱基编辑，为临床治疗高胆固醇血症等遗传性疾病提供了安全高效新方法和新工具。

在该项研究中，研究团队首先构建出了一种可以简便、快速的定量检测碱基编辑器中sgRNA非依赖性脱靶突变的方法—CESSCO。进一步，利用mA3dCDI 结构域的抑制脱氨功能这一特性构建了tBE系统，tBE可以在脱靶位置处保持“锁定”状态，而只有在靶向位点才能通过切割mA3dCDI结构域来“解锁”进行碱基编辑（图1）。结合高通量测序技术和计算生物学的研究方法，研究人员系统评估了tBE的编辑效率、脱靶效应和编辑产物纯度，结果显示tBE碱基编辑系统可以在执行高效C-to-T编辑的同时，最大程度地减少由locator产生的Cas9/sgRNA依赖性脱靶效应（sgRNA-dependent off-target，OTsg）和effector产生的Cas9/sgRNA非依赖性单链DNA脱靶效应（sgRNA-independent single-stranded off-target，OTss）。该研究还构建了在全基因组检测脱靶的计算分析流程BEIDOU（Base/Prime Editor Induced DNA Off-target site identification Unified toolkit，https://github.com/YangLab/BEIDOU）（图示B），并结合全转录组RNA脱靶鉴定工具RADAR（RNA-editing Analysis-pipeline to Decode All twelve-types of RNA-editing events，https://github.com/YangLab/RADAR）（Wang et al., Cell Rep 2020），证明了tBE具有与本底水平类似的全基因组和全转录组突变效应，提示tBE不具有早期BE的脱靶效应。

图1：tBE的作用原理以及BEIDOU脱靶检测流程 (A) tBE作用的原理示意图。以tBE -V5–mA3为例，其可在靶位点切除dCDI产生高效编辑效果，但在OTss和OTsg位点时由于dCDI的存在可以抑制脱靶突变。(B) BEIDOU计算分析流程评估碱基编辑器的潜在全基因组水平脱靶。

另一方面，虽然腺相关病毒介导的递送方式已经被广泛应用，但是单个AAV载体的包装上限为4.7 kb。而传统的APOBEC-Cas9融合构型碱基编辑系统已经远超这一包装上限。由多个单独组分组装而成的tBE系统打破了传统碱基编辑器APOBEC-Cas9的构型，因此能够便利地被包装进Dual-AAV系统中来实现体内递送。tBE系统也提供了一个无脱靶的高效精准型碱基编辑器的构建范式，为碱基编辑系统在临床治疗方面的应用提供了安全高效的新方法和新工具。

该论文中，上海科技大学陈佳教授，中科院上海营养与健康研究所杨力研究员，武汉大学殷昊教授和上海科技大学杨贝教授为共同通讯作者，陈佳研究组毕业生王丽洁博士，杨力研究组博士研究生薛尉，殷昊研究组博士后张红霞，陈佳研究组博士研究生高润泽和殷昊研究组博士研究生邱厚圆为共同第一作者，陈佳教授、杨力研究员、殷昊教授和杨贝教授为共同通讯作者。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41556-021-00671-4