胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）是成人最常见的一种恶性脑肿瘤，约占脑和其他中枢神经系统恶性肿瘤中的48.6%，目前缺乏有效的临床治疗手段，患者平均5年生存率只有7%，平均存活时间仅有12个月。临床基因组分析表明，在超过一半的GBM中发现了表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）基因改变，主要包括EGFR基因扩增和突变等功能获得性突变。虽然面向GBM通过靶向EGFR抑制进行了一系列药物研发，但是并未从根本上改善患者的生存率。除了GBM中的EGFR突变使药物会很快产生耐药外，其他耐药机制大多仍未明确，可能来自于药物对肿瘤组织的渗透不足，或是存在冗余的信号通路变化使得肿瘤细胞从EGFR激酶抑制的作用中逃逸。因此，寻找GBM中除了EGFR突变之外的反应信号传导或代谢途径，将有可能为克服耐药及联合治疗策略提供基础。基于此，来自美国的研究人员发展了基因组功能筛选的方法，并最终发现了靶向EGFR的药物neratinib作用的新通路及其机制。
首先，研究人员利用泛ErbB激酶不可逆抑制剂neratinib处理EGFR突变的SF268 GBM细胞，结合全基因组CRISPR-KO筛选，从而富集发现了抗性靶标，如一般性调控阻遏蛋白2（general control nonderepressible 2，GCN2）的sgRNA EIF2AK4。研究发现，GCN2缺失会增强EGFR突变GBM细胞对neratinib的抗性，进一步在对人源TS895球型的GBM细胞进行体内和体外敲除GCN2后，也观察到对neratinib的抗性提高。
在筛出了GCN2这一抗性基因后，为了探索neratinib通过GCN2发挥作用的下游信号通路，研究人员分析了筛选到的与neratinib抗性相关的其他基因：例如，GCN1，在整合应激反应（integrated stress response ，ISR）中可将不带氨基酸的tRNA结合到GCN2上并促进其磷酸化激活；其次，ATF4，作为ISR的另一个成员，该基因位于GCN2下游，细胞生长实验证实ATF4-KO能够增强对neratinib的抗性，免疫印迹实验也显示出了GCN2的激活和ATF4表达量的增加密切相关；除此之外，GADD34，作为该通路中的负调节因子，敲除GADD34会增强GBM细胞对neratinib的敏感性，细胞生长被抑制，促进细胞凋亡，而回补GADD34又会抑制细胞凋亡，增强药物抗性。综上，结合GCN2的结果，他们推导出neratinib在GBM细胞中除了抑制EGFR外，还会通过GCN2/ATF4通路的持续激活，从而促进细胞死亡。
为了探究neratinib导致的EGFR抑制和GCN2激活之间的关联性，研究人员首先检测了两条通路的剂量反应关系，发现它们作用浓度无交叉且趋势无相关。此外，用EGFR下游效应蛋白抑制剂处理对GCN2通路无效应，不同细胞中不同的EGFR表达水平也与neratinib诱导的ATF4表达水平无关。值得注意的是，在对neratinib耐药的EGFR和HER2双突变细胞中，EGFR的激活不再受抑制而GCN2通路还是照样激活，这些证据都表明neratinib对EGFR抑制和GCN2激活两条通路的影响是无关联的。
在排除了氨基酸缺乏导致GCN2通路信号激活的可能性后，研究人员猜测neratinib可能是直接结合并激活GCN2。因而，他们利用ATP替代实验发现neratinib会剂量依赖性与ATP竞争结合GCN2，且同位素标记ATP实验测得neratinib剂量依赖性激活GCN2的激酶活性，提示了neratinib直接结合GCN2并激活其活性。
在此基础上，研究人员筛选了其他激酶抑制剂对GCN2激活的普适性。根据NIH LINCS KINOMEscan的数据，他们发现除了neratinib，还有其它一些激酶抑制剂会结合GCN2，例如erlotinib和gefitinib可以结合，但非可逆二代抑制剂的canertinib并不结合。为了分析这些不同类型的激酶抑制剂激活GCN2的原因，研究人员对EGFR结合neratinib和GCN2结合dovitinib的激酶结构域的晶体结构进行比对，提出neratinib可能是结合进GCN2的激酶结构域中不同区域从而关闭ATP结合口袋。
为了阐明neratinib能激活GCN2激酶活性这一反常现象的机制，他们使用更大范围的抑制剂浓度进行体外放射性激酶活性实验，发现GCN2的活性是随着抑制剂浓度先增高后减弱，特别是在没有tRNA存在时也能激活GCN2。基于此，研究者提出：neratinib与GCN2二聚体中其一结合并诱导构象变化，稳定tRNA结合并通过未结合的单体导致酶活性增强，neratinib浓度的进一步增加导致两个激酶结构域都结合药物，最终导致GCN2激酶活性降低。
综上，研究者通过全基因组功能筛选找到了靶向肿瘤EGFR突变的激酶抑制剂作用新机制，发现neratinib通过EGFR抑制和意料之外的GCN2激酶的激活来共同抑制肿瘤细胞生长和肿瘤细胞死亡，并提出了一个类似于RAF蛋白二聚体被其自身激酶抑制剂反式激活的模型，不过这种激酶抑制剂“脱靶”激活的效应是之前所没想到的，这种抑制剂激活激酶启动GCN2/ATF4轴的效应可能在未来的激酶抑制剂中得以应用以增强其抗肿瘤活性。
[1] Miller, K. D. , et al. "Brain and other central nervous system tumor statistics, 2021." CA: a cancer journal for clinicians 71.5:381-406.
[2]An, et al. "Epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma: signaling pathways and targeted therapies." Oncogene (2018).
[3] Pan, P. C. , and R. S. Magge . "Mechanisms of EGFR Resistance in Glioblastoma." International Journal of Molecular Sciences 21.22(2020):1-21.
[4]"GCN2 kinase activation by ATP-competitive kinase inhibitors." Nature Chemical Biology.
[5] Poulikakos, P. I. , et al. "RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF." Nature 464.7287(2010):427-430.
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