NAR | 郭雅彬/张寅合作利用CRISPR-Cas9靶向基因组重复序列实现人类基因组全局性染色体重排

染色体重排在物种进化、个体发育、以及肿瘤发生中起着至关重要的作用，然而我们对其演变机制和后续影响的认识仍只是冰山一角。例如以前认为细胞癌变过程中染色体重排的发生是一个持续而漫长的过程，但近年有一种“染色体碎裂”（chromothripsis）的研究观点认为肿瘤细胞染色体重排是由一个单一的灾难性事件引起的。由于哺乳动物拥有非常复杂的基因组和染色质三维结构，缺乏有效诱导染色体重排的方法，目前对于肿瘤染色体重排的研究只能局限在病人标本中进行观察研究，往往只能观察到发生后的状态，而无法在体外可控的诱导产生染色体重排。如果有一个全局性染色体重排的模型将给这方面的研究带来很大便利，加快染色体重排机制的研究。

近日，中山大学孙逸仙纪念医院的郭雅彬研究员/张寅副研究员团队在Nucleic Acids Research发表了题为Global chromosome rearrangement induced by CRISPR-Cas9 reshapes the genome and transcriptome of human cells的研究论文（第一作者：刘颖、马广伟）。该研究中，作者发明了诱导哺乳动物细胞发生全局染色体重排的方法CReaC，利用CRISPR-Cas9靶向人类基因组多拷贝数的逆转座子LINE-1/Alu，首次在人类细胞中实现了全局性染色体重排，这在国内外该研究领域中属于首创。染色体重排后存活的细胞具有类似癌细胞的基因拷贝数变化和信号途径激活，为研究肿瘤染色体重排提供了有力的技术手段。

此前，人们多是利用CRISPR-Cas9靶向普通的基因，它们在二倍体基因组中对应2个位点。杨璐菡和Church团队曾用CRISPR-Cas9成功敲除了猪细胞中的60多个PERV（猪内源逆转录病毒）拷贝，是迄今人们所知道的CRISPR-Cas9多拷贝基因编辑的上限。然而多拷贝基因编辑的潜力不会止步于此，真核基因组中还含有许多拷贝数成千上万的序列，比如占人类基因组17%的逆转座子LINE-1和占比约11%的逆转座子Alu，如果用CRISPR-Cas9靶向这些高度重复的序列，让Cas9大量切断染色体，就如扯落一串珍珠项链，散落的珍珠以随机的方式重新排列，即引发全基因组水平的重排。

基于这个疯狂的猜想，研究者依据人类L1和Alu序列最保守的区域设计了sgRNA，它们分别在参考基因组hg38上7398个和317924个位点，并设计了一条与hg38无匹配的序列作为sgNC。三个sgRNA分别被克隆pSB-CRISPR载体中，SB100X转座酶把含有Cas9、sgRNA和嘌呤霉素抗性基因的一段序列整合入来源于人胚胎肾脏的HEK293T细胞基因组。细胞在嘌呤霉素筛选压力下持续表达Cas9和sgRNA，不断地切割染色体，进而引发全局性染色体重排。研究者将这种用CRISPR-Cas9靶向重复序列引发染色体重排的方法命名为CReaC（Chromosome Rearrangement by CRISPR-Cas9）。

事实上大部分细胞无法耐受CReaC造成的广泛DNA损伤，在筛选过程中即死亡，只有一少部分细胞存活下来并在3-4周后恢复稳定增殖。核型分析显示这些细胞染色体结构和染色体数目都发生了明显改变，证实它们确实发生了剧烈染色体重排，可以作为研究染色体重排的模型。研究者分别命名三种细胞为GCR-L1、GCR-Alu和NC。

研究者对这些细胞进行多组学研究，发现GCR细胞在各个层面上都发生了显著的变化：

二代全基因组测序显示染色体发生了很剧烈的重排，在两个细胞群中都找到了500次左右的染色体易位/倒位。三代ONT测序发现了很多跨越靶向位点LINE-1/Alu的易位。而基因拷贝数的变化（CNV）则显出了类似肿瘤细胞的CNV。

ATAC测序显示GCR细胞核小体的排布周期变得紊乱，失去了NC细胞中表现出的规律性。GCR细胞的整体染色质的可及性降低，但总的转录强度反而增加了。这倒并不意外，因为重排势必会产生很多错误的嵌合RNA，但细胞要生存总还要表达足够的“正确的RNA”，于是总RNA不可避免地变多了。细胞处于RNA高合成和高降解的非常状态。

转录组测序的结果则显示，DNA复制、RNA合成、蛋白质合成等最基本的生理过程都发生了深刻的改变，尤其是细胞周期检查点、DNA损伤修复、凋亡、癌症相关通路被显著富集，细胞在短时间内进化出有利基因型，改装转录组以带着不稳定的基因组持续前进。

总体而言，研究者使用CReaC技术首次实现了哺乳动物基因组的全局性重排，为今后研究①染色体重排对基因表达的影响，②染色体重排对表观遗传学修饰的影响，③染色体重排与细胞癌变都提供了有力的工具。基因组中的转座子等重复序列，曾一度被称为“垃圾DNA”，随着高通量测序的容量越来越大，转座子势必会日益受到重视。本项目首次尝试的超多拷贝的CRISPR基因编辑方法除了研究染色体重排，对于高度重复的转座子/逆转座子的研究也有望提供一个有力的工具。

原文链接：

https://doi.org/10.1093/nar/gkac153

制版人：十一

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