Nat Commun | 武大雷/罗成等合作发现OEA为缺氧诱导因子HIF-3α内源配体并揭示其调控机制

缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factors, HIFs）是细胞内的氧气感受器，作为转录因子发挥重要生理调控功能【1】。具有转录活性的HIF蛋白复合体由HIF-α和ARNT（即HIF-1β）两个亚基组成【2】，而HIF-α有三种亚型，分别由三个不同基因编码。在常氧条件下，脯氨酸羟化酶以氧气为底物，将HIF-α特定位点的脯氨酸羟基化，进而通过泛素连接酶VHL介导HIF-α降解，维持HIF通路活性在较低水平；而缺氧条件下，HIF-α因羟基化受阻而保持稳定，入核后激活相关下游基因转录，帮助细胞适应缺氧环境【3】。

除了以上基于氧气水平的调控，HIF-α蛋白还可以被人工合成的小分子配体直接结合并调节其转录活性。其中HIF-2α的抑制剂最先被发现，经过多年开发2021年被FDA批准上市（Belzutifan），用于治疗肾透明细胞癌等疾病；而其首个激动剂也由武大雷等在2019年发现，具有治疗肾性贫血的潜在功能【4】。然而直接靶向HIF-α蛋白并调控其活性的内源小分子此前尚未发现，探寻内源性配体也一直是HIF研究领域的热点问题之一。

2022年5月9日，山东大学微生物技术国家重点实验室武大雷团队、中科院上海药物所罗成团队和牛津大学Fraydoon Rastinejad团队合作在Nature Communications上在线发表了题为Identification of oleoylethanolamide as an endogenous ligand for HIF-3α的论文。该研究通过基于蛋白-小分子互作的高通量化合物筛选，首次发现直接结合HIF-3α蛋白的脂类内源配体油酰乙醇胺（Oleoylethanolamide，OEA），并利用蛋白-化合物共晶、分子动力学模拟、氢氘交换质谱等手段，发现OEA进入HIF-3α蛋白的通道，最终揭示OEA促进HIF-3α与ARNT二聚作用的变构调节机制。

研究发现，OEA结合HIF-3α后可以促进HIF-3α-ARNT异二聚体稳定性，增强HIF-3α对下游基因HSPA6的转录活性（图1 a,b）。通过解析HIF-3α-ARNT-OEA复合物结构，结合分子动力学模拟，发现OEA结合促进HIF-3α PAS-B结构域与ARNT PAS-A和PAS-B结构域之间loop（A/B loop）相互作用（图1c）；利用氢氘交换质谱分析，发现OEA结合促进HIF-3α PAS-B结构域Fα helix与Gβ strand上多个氨基酸的稳定性（图1d），被稳定的Fα helix与Gβ strand形成稳定夹层进一步促进其与A/B loop的相互作用，揭示了OEA发挥激动活性的分子机制。

图1 OEA结合HIF-3α并调节其活性的分子机制（a. TR-FRET研究OEA对HIF-3α-ARNT（HIF-3）异二聚体稳定性的影响；b. qPCR测定OEA对HIF-3α下游基因HSPA6转录活性的影响；c,d. 利用分子动力学模拟与氢氘交换质谱方法，分析OEA对ARNT A/B loop稳定性的影响）

OEA通过打开HIF-3α的loop-Aβ位置结合到PAS-B口袋中，形成了清晰的配体结合通道（图2 a,b），分子动力学模拟显示HIF-3α PAS-B的loop-Aβ具有较强的灵活性，可以在“关闭”和“打开”两种构象中变化（图2c），结合生化和细胞实验，提出了配体进入HIF-3α PAS-B口袋的路径。此外，为了探究配体调控HIF-α亚基活性的普遍规律，该研究对HIF-2α进行了比较分析。发现HIF-2α PAS-B的loop-Aβ也具有一定的灵活性（图2d），说明配体也可能从相似的路径进入其口袋，为靶向HIF-α亚基的PROTAC分子设计等提供了重要参考。

图2 配体结合HIF-α的路径（a,b. OEA结合打开HIF-3α PAS-B的loop-Aβ c. HIF-3α的loop-Aβ具有较高的灵活性d. HIF-2α的loop-Aβ也具有灵活性）

综上，此项研究发现了首个直接靶向HIF-α的内源配体OEA，说明除了响应氧气浓度的、利用脯氨酸羟化酶等对HIF-α的修饰调节机制外，生物体中存在直接结合并调节HIF-α活性的内源配体，包括与代谢紧密相关的分子，揭示了生理状态下缺氧诱导信号调控的多样性。OEA是油酸等的天然代谢产物，具有诱导厌食和抑制体重增加的生理作用，目前发现其体内的作用靶点还包括PPARα、TVRP1和GPR119等。而HIF-3α也参与脂代谢信号通路的调控【5】，并且其表达水平与肥胖相关【6】。因此OEA是否能够通过调节HIF-3α参与脂代谢，还需要进一步的深入研究。

本论文通讯作者为山东大学武大雷教授、上海药物所罗成研究员和牛津大学Fraydoon Rastinejad教授，第一作者为山东大学博士研究生刁晓彤同学和浙江理工大学叶飞教授。

武大雷教授团队主要针对转录因子相关的靶标蛋白，从事结构与分子药理学研究和靶向分子发现，此外也开展生物合成相关酶的结构解析和催化机理研究。现诚聘冷冻电镜结构生物学和细胞生物学方向的博士后、助理（副）研究员。详情请见课题组网页：

https://faculty.sdu.edu.cn/WuLab/zh_CN/index.htm

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原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41467-022-30338-z

制版人：十一

参考文献

1. Semenza, G.L., Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol, 1999. 15: p. 551-78.

2. Wu, D., et al., Structural integration in hypoxia-inducible factors. Nature, 2015. 524(7565): p. 303-8.

3. Jaakkola, P., et al., Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation. Science, 2001. 292(5516): p. 468-72.

4. Wu, D., et al., Bidirectional modulation of HIF-2 activity through chemical ligands. Nat Chem Biol, 2019. 15(4): p. 367-376.

5. Cuomo, F., et al., HIF3A Inhibition Triggers Browning of White Adipocytes via Metabolic Rewiring. Front Cell Dev Biol, 2021. 9: p. 740203.

6. Shen, J., et al., HIF3A DNA methylation, obesity and weight gain, and breast cancer risk among Mexican American women. Obes Res Clin Pract, 2020. 14(6): p. 548-553.

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