EMBL报道新方法｜数字PCR快速筛选早期CRISPR-Cas9编辑细胞，时间从30天减到10天

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关键词：细胞新方法

资讯来源：BioArt

发布时间： 2022-06-16

基因编辑技术是通过某种生物手段和技术对生物体内的遗传物质进行修改，指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。CRISPR-Cas9基于原核生物的获得性免疫系统研发，通过这种技术科研人员可以对细胞和生物体内的基因进行编辑，包含两种重要的成分，一种是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，而另一种则是具有导向功能的sgRNA（single guide RNA）。当细胞内同时表达sgRNA和Cas9蛋白时，Cas9蛋白通过与sgRNA结合，靶向到目的DNA序列上发挥DNA双链切割的功能。DNA序列被切割产生断裂后，引发细胞内部的DNA修复机制（DNA repair）。真核细胞同时存在着同源重组修复和非同源重组修复。在同源重组修复下，断裂的染色体以另一条完整的姐妹染色单体为模板进行DNA修复，而在非同源重组修复下，断裂出的DNA随机修复，引入新的碱基，使基因产生移码突变。

CRISPR结构示意图

CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。但是在CRISPR基因组编辑之后，工作并没有结束，尽管设计CRISPR/Cas9基因组编辑试剂可以在细胞系和不同模式生物中感兴趣的位点产生敲入，通常需要通过几百个克隆进行筛选，以确定那些携带所需的基因修饰而没有脱靶变化的克隆，维护和筛选大量的克隆是一个费时费力、耗时、容易出错的过程。当试图在多倍体细胞中产生纯合子敲入时，这个问题变得特别具有挑战性，如人类癌症衍生的细胞系，HeLa或U-2OS。

使用常规PCR区分纯合克隆和杂合克隆的方法只能检测到目的基因，还需要金标准Southern Blot检测脱靶整合的情况，然而，Southern Blot是一种耗时且低通量的技术，需要相对大量的基因组DNA和细胞材料，这些材料的制备会浪费大量的时间和人力成本。针对上述问题，Moritz Kueblbeck等人优化了CRISPR的实验流程，改进了CRISPR的转染效率，通过添加荧光标签蛋白实现CRISPR编辑的克隆菌落中相关标记蛋白的正确亚细胞定位，并通过dPCR 来定量目的基因和脱靶基因组编辑事件。通过该方法，快速、可靠的对荧光标记CRISPR编辑细胞进行了定量筛选。

使用PCRNP方法生成和验证CRISPR基因组编辑细胞系流程

通过电穿孔传递CRISPR组件后，荧光细胞通过FACS被分选到96孔板。然后，筛选单克隆菌落进行深入分析。关键点在于，数字PCR（dPCR）用于筛选步骤，以评估标签整合的数量和选择感兴趣的基因型进行后续培养。CRISPR流程持续大约10周。操作时间显示在右侧。