mRNA作为生物中心法则的一个中间角色，一直备受关注。2010年前后，LNP递送技术的突破，促进了mRNA的大发展，使其成为当下最具代表性的新技术之一。
mRNA的应用场景非常宽广，除了目前我们了解到的肿瘤疫苗、传染病疫苗
（尤其是新冠）
之外，mRNA未来的应用场景会逐渐向其他领域扩展，比如蛋白替代。因此，这里面也充满了不少机会。
恺佧生物成立于2018年3月，目前有近200名员工，80%从事生产研发。
在平台建设上，我们开发了独有的创新型功能重组蛋白和抗体研发生产SAMS™平台，以及分子克隆、细胞培养、蛋白纯化和质控平台、酶促反应分析平台、细胞功能评价平台，MES生产管理体系。
目前，我们已建有GMP车间、实验室和办公面积近5000平方米，一流的分析仪器和生产设备配置，以及即将投产的上万平方米上海临港二期GMP车间，使得我们具备过亿元订单年交付能力。截至目前服务超过250家生物医药和诊断客户，参与2000多个目录蛋白产品。
我们主要聚焦新兴治疗领域的关键上游原材料，除了mRNA疫苗。还包括抗体药发现I/O、基因治疗、细胞治疗等。
mRNA合成过程中使用的酶关键指标的质控，对下游企业的生产工艺稳定性至关重要。随着整个产业链的逐渐发展和成熟，未来对酶的要求也会逐渐提高。除了符合CGT领域原料酶的GMP申报要求，恺佧所有酶都经过高精确活性定量放行，比如特别引进了LC-MS系统对加帽酶和2'-O-甲基转移酶进行测活放行。
从早期质粒的信息化，到mRNA的合成、加帽、加尾，整个过程需要一系列的酶。我们可以提供不同的选择方案。
首先一个产品是BsaI。这个酶在科研领域里有非常多的应用，应用时间也很长，但BsaI添加了BSA作为保护剂和稀释剂，在工业领域可能出现问题。因为BSA一般来自动物，即使采用重组的BSA，还是容易带来蛋白残留控制的压力。考虑到这两个痛点，我们直接通过优化配方摆脱BSA。
为了印证方法的可靠性，我们进行反复的冻融实验。我们将带BSA和不带BSA的酶进行对比，在37℃的环境下，30分钟的反应没有任何区别，持续到16小时继续观察无星活情况。可以看到，加不加BSA的效果是一样的。
我们还做了一个37℃的加速实验，也分别在30分钟和16小时的质粒酶切反应时间进行对比，考察其活力和星活情况。在前4天的37℃加速实验，活力基本上没有影响。第5天时稍微会有一点影响，但在实际的使用场景里基本不会发生，因为我们不太会把酶暴露在37℃环境下长达5天。
其次是噬菌体T7，这可能是我们整个mRNA生产过程中最核心的一个酶，是非常高效的单结构蛋白。T7和细菌、真核生物对比，后二者分别有5个亚基、12个亚基。如果是这样的生产工具，单单生产和表达，难度、成本都会非常大。因此，T7是最理想的一个生产工具。
T7在科研领域也得到很长时间的应用，而工业领域对产量要求比较高，涉及疫苗生产成本。到达终端，则影响患者的可及性。
T7有多种影响因素，包括酶、模板、镁离子、NTP的核心四要素，以及一些辅助因素，像表面活性剂焦磷酸酶DTT，还有亚氰胺、阴阳离子，都可以通过调整配方，实现高产率的开发。
但具体操作时，还是存在一定难度。每一个因素都有一个最适浓度，不同因素的最适浓度不是简单的叠加，比如镁离子和NTP，如果镁离子浓度比较低，很有可能会被NTP耦合，造成T7能有效利用的镁离子减少，最终导致低产率。
我们可以通过DOE的方法开发配方。通过从多因素的高低浓度，到关键因素的中高低浓度，再到一些精细的筛选，我们实现了结合数学模型的DOE方案进行开发。
双链RNA的形成机制有两条。第一条是形成机制，也就是在特定的情况下，T7可能不会依赖于T7启动制，形成一个错误的转录。但模板如果带有polya结构，则可以非常高效地进行抑制该机制。
第二条是转录完成之后没有及时解离，继续利用mRNA本身作为模板，反向合成互补链，称为3’端延伸。根据专利文献，在50℃高温条件下，T7酶和RNA结合的力度会受到影响，在末端及时解离，从而降低双链RNA的产生几率。而50℃高温对一次性反应设备不太友好，无法用于工业规模的生产。但我们找到了其它的解决策略，通过对T7酶和buffer的优化来最大限度的减少双链RNA的3’端延伸。
我们做了一个验证实验，采用了一个短模板进行转录，再进行尿素电泳，可以看到对比两家国外竞品恺佧的酶在不同盐离子浓度强下产生的3’端延伸非常少。换言之，要解决双链RNA的问题，最好的办法是防胜于治，我们的T7系统可以很好的解决这方面的痛点。
在T7酶活精确定量方面，早期方法的稳定性差异很大。例如转录产量法，正负30%都很正常。因此，我们后来开发了独创性的探针法，将探针的结合位点放在2000nt的模板尾端，只有合成完整的RNA，信号才会被捕捉到。在我们的分析里，分别投入50U、40U和30U，观察反应速率和差异，对酶活进行精确定量。
基于这样的方法，我们对T7酶在37℃加速实验和反复冻融的稳定性研究，可以看到它的一个活性基本上能维持在90%以上。
此外，我们还对无焦磷酸酶、DNase I进行了研究。无焦磷酸酶对产率的影响非常明显，大概有30%~40%以上的提高；而高活性DNase I可以高效去除转录模板。
加帽方法目前是分为两种，一种是共转录加帽，目前处在第三代，也就是以Cleancap为代表的共转录方式；另外一种是牛痘加帽酶法加帽，它可以实现非常高的加帽率，接近100%，这也是我们推荐的方法。
为什么需要这么高的加帽率？大量的研究已经证明，从Cap1、Cap0，再到不加帽，免疫原性是逐渐提高的。为了降低疫苗的免疫原性，我们需要实现尽可能高的Cap1加帽率。
Cap1其实是在两个酶的共同作用下实现的，一个是加帽酶，另一个是甲氧基转移酶。那么，共转录加帽法和酶法加帽哪个更好？
我们可以从两个维度进行分析。第一个是加帽率，像Cleancap这种方式的加帽率，一般在90%~95%左右；而酶法加帽的加帽率，可以接近100%。技术上来说，后者更有优势。
第二个维度是成本，酶法加帽在IVT之后，需要多一套纯化工艺再进行加帽，再加上设备成本，都会导致整体成本的增加。但同时需要注意，Cleancap结构拥有专利，后期会有license-fee的问题。
就总体考虑，行业详细估算过，目前这两个成本非常接近，如果考虑license-fee，可能酶法加帽更有优势。尤其是随着未来产业的逐渐成熟，以及酶法加帽生产规模不断扩大，成本分摊会更低，能够帮助疫苗企业实现成本降低。恺佧的加帽酶经过改造，产率相比野生型有了很多倍的提高，希望能够为业界赋能。
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