Nat Biotechnol | 突破PAM限制——刘如谦开发新策略推动小型Cas9升级换代

撰文 | 木兰之枻

CRISPR-Cas系统是基因编辑领域的革命性工具，已在基础研究和临床转化中展现出强大的实力。不过CRISPR-Cas系统对靶位点的识别和编辑依赖于特定的PAM序列，这极大的限制了CRISPR-Cas为基础的精准基因编辑技术的发展和应用。近年来，研究者采用各种策略对SpCas9进行升级改造，这使其PAM识别序列从传统的NGG拓展至NG、NRN甚至NYN，有效拓展了SpCas9及其衍生工具的应用前景 （特别推荐丨基因魔剪CRISPR/Cas9新进展——新型利器xCas9 3.7利刃出鞘；Science | 摆脱PAM困扰—Cas9强势升级获得基因编辑新利器SpRY） 【1-5】 。目前各类SpCas9的突变体对嘌呤类PAM位点 （NRN） 编辑效果良好，但在嘧啶类PAM位点 （NYN） 仍有不足。

此外，SpCas9还存在体积大 （1368氨基酸） 难递送等不足，这不利于其未来的广泛应用。为此研究者对小体积的Cas9系统进行了系列探索并取得众多成果 【6】 。不过小型Cas9系统的PAM较SpCas9更加局限，且缺乏深入的研究和改造。如何突破小型Cas9的PAM限制是领域内的难点和痛点。

2022年9月8日，来自美国哈佛大学Broad研究所和霍华德休斯研究所 （HHMI） 的 David Liu 实验室与波士顿大学 Ahmad S. Khalil 实验室合作在 Nature Biotechnology 发表题为 High-throughput continuous evolution of compact Cas9 variants targeting single-nucleotide-pyrimidine PAMs 的论文。文章 借助升级后的蛋白定向演化系统，对小型Cas9系统Nme2Cas9进行了系列的优化和改造。改造后的Nme2Cas9突变体成功突破了传统PAM（N4CC）的限制，可有效识别N4YN类型的PAM并实现高效的基因编辑。

David Liu实验室曾开发出蛋白定向演化技术——噬菌体辅助连续演化系统 （PACE） 【7-8】 用于拓展SpCas9的PAM识别位点。传统PACE系统主要依赖于Cas9 PACE对PAM位点的识别以推动蛋白定向演化。考虑到小型化Nme2Cas9与SpCas9在核酸酶动力学速度的差异，仅PAM位点识别难以满足Nme2Cas9的优化需求。为此研究者开发出升级版的SAC-PACE，新系统依赖于PAM位点识别和后续的单碱基编辑以实现蛋白定向演化。此外，考虑到传统PACE难以开展高通量大规模筛选，研究者还将PACE与eVOLVER连续培养平台有机结合，并设计整合微流体式集成蠕动泵，最终开发出新型ePACE系统以实现高通量和规模化的蛋白定向演化。ePACE设计开发完成后，研究者还通过对麦芽糖结合蛋白MBP的定向优化验证了系统的可靠性，为后续Nme2Cas9的优化奠定了基础。此外研究者还开发出了具有更高灵敏度的新型PAM分析策略BE-PPA，以更好更快的评估Nme2Cas9的PAM识别位点。

设计完成SAC-PACE，ePACE和BE-PPA三种新型筛选平台/策略后，研究者选择Nme2-ABE8e单碱基编辑器为起始工具以拓展Nme2Cas9的PAM识别位点。经过初步的定向演化后，Nme2-ABE8e展现出的PAM偏好性为N ₃ NCG < N ₃ NCA < N ₃ NCT < N ₃ NCC。研究还发现Nme2-ABE8e对N ₃ NTCC型PAM位点也有很好的编辑活性。综上我们可知Nme2Cas9的定向演化有两种途径，一是获得可识别N ₄ TN型PAM的突变体，一是获得识别N ₄ CN型PAM的突变体 （图1） ，其中N ₄ CN更容易实现。此外考虑到SpCas9在嘧啶类PAM位点处表现欠佳，开发可识别N ₄ CN型PAM位点的Nme2Cas9突变体意义重大。

图1 Nme2Cas9的优化路径。

研究者首先选择低严紧度的SAC-PACE平台尝试开发可识别N₄TN型PAM位点的Nme2Cas9突变体。但数轮筛选后的结果显示，低严紧度的SAC-PACE筛选策略难以获得可高效识别N₄TN型PAM位点的Nme2Cas9突变体。随后研究者又尝试利用内含肽拆分Nme2-ABE8e以限制其活性，从而提升严紧度。但拆分型SAC-PACE策略的筛选结果依然不尽人意。随后研究者又引入多重PAM筛选策略，通过与拆分型SAC-PACE联用进一步提升了严紧度。

之后研究者利用优化改造后的策略筛选可识别N₄CN型PAM位点的Nme2Cas9突变体。通过新策略的微调和多轮筛选，研究者获得了可有效识别N₄CN型PAM位点的突变体eNme2-C，对应的单碱基编辑器eNme2-C-ABE8e在哺乳动物细胞中也展现出明显的编辑活性。HEK293T细胞中的结果显示，eNme2-C-ABE8e在N₄CC和N₄CD PAM位点的编辑效率均显著优于野生型Nme2Cas9。随后研究者还筛选出可识别N₄TN型PAM位点的Nme2Cas9突变体eNme2-T.1和eNme2-T.2，其对应的单碱基编辑器eNme2-T.1-ABE8e和eNme2-T.2-ABE8e在HEK293T细胞中同样展现出良好的编辑活性。

成功开发出可识别N₄CN和N₄TN型PAM位点的Nme2Cas9突变体后，研究者还对其与SpCas9突变体SpRY （可识别NCN和NTN型PAM） 进行了比较分析。结果发现与SpRY-ABE8e以及高保真型SpRY-HF1-ABE8e相比，可识别N4CN型PAM位点的eNme2-C-ABE8e具有更优的碱基编辑能力。不过可识别N4CN型PAM位点的eNme2-T.1-ABE8e和eNme2-T.2-ABE8e则弱于SpRY衍生的单碱基编辑工具。研究者还证实，除ABE外，eNme2-C衍生的CBE工具eNme2-C-BE4同样优于SpRY-BE4和SpRY-HF1-BE4。研究还发现，eNme2-C中增强单碱基编辑活性的多种点突变会抑制其核酸酶活性，为此研究者对相关位点进行回复突变，最终获得的eNme2-C.NR保持有识别N₄CN型PAM位点的能力和高效的核酸酶活性。而且与SpRY和SpRY-HF1相比，eNme2-C.NR的核酸酶活性更强。研究还指出，与SpRY及SpRY-HF1相比，改造后的Nme2Cas9突变体具有更低的脱靶效应。

研究者最后还证实，Nme2Cas9突变体及衍生工具在多种细胞系中均有良好的碱基编辑能力。其中可识别N4CN型PAM位点的eNme2-C-ABE8e在致病点突变诱导和修复方面也展现出优势：RBM20基因的D674G突变难以通过SpRY及衍生工具进行诱导和研究，但eNme2-C-ABE8e可高效诱导出该突变 （效率达33%） 。研究者还证实，，eNme2-C-ABE8e在镰刀细胞贫血的点突变修复上也具有优势，其效率与SpCas9突变体衍生工具相当，但脱靶风险更低。

总体而言，研究者对前期的蛋白定向演化技术进行了系统整合和全面升级，最终开发出全新的蛋白定向演化筛选平台并成功用于小型Cas9的PAM识别位点改造。本研究有效拓展了Nme2Cas9的PAM识别位点（从传统的N₄CC拓展至N₄CN和N₄TN），开发出的新型Nme2Cas9突变体为精准基因编辑提供了全新的工具，极大的拓展了精准编辑工具的应用范围。此外本研究还为后续各类CRISPR-Cas系统的改进奠定了基础。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41587-022-01410-2

制版人：十一

参考文献

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8.  Roth, T. B., Woolston, B. M., Stephanopoulos, G. & Liu, D. R. Phage-assisted evolution of Bacillus methanolicus methanol dehydrogenase 2. ACS Synth. Biol. 8, 796–806 (2019).

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